Μοριακή σταδιοποίηση του καρκίνου του πνεύμονα

Abstract

Disseminated disease is the primary cause of mortality among lung cancer patients. Recent research data indicate that cancer cells disseminate to secondary sites very early during tumour development, and subsequently lead to cancer evolution. Cancer cells that detach from the site of the primary tumor, are called circulating tumor cells (CTC). These cells disseminate via the blood circulation and form metastasis in coastal or distal sites, without been detected by current imaging techniques. CTC detection in lung cancer patients΄ peripheral blood, is a promising tool for the detection of residual cancer disease. Τhe presence of CTC in bloodstream is associated with the development of systemic disease or high risk of recurrence. Furthermore CTC count is also particularly useful for monitoring response to therapy. Clinical utility of such monitoring of therapeutic effectiveness lies in the opportunity to check its success or to rapidly terminate ineffective treatment in order to prevent side effects and unnecessary costs. Early diagnosis, accurate staging and the appropriate curative treatment, determine the good prognosis of the disease. A strategy for the determination of CTC as a prognostic or diagnostic biomarkers, could help physicians make treatment decisions that might lengthen a person’s life expectancy after their cancer diagnosis. Current Clinical Oncology guidelines do not yet support the individual routine use of CTC assays in clinical use, mainly due to the lack of standardized protocols. The aim of this study was the establishment of a non-invasive, simple, short term and sensitive method, which would reveal the presence of CTC in peripheral blood of lung cancer patients. This test doesn’t detect LC but may improve lung cancer staging process. Multiplex polymerase chain reaction predominates over simple PCR due to simultaneous amplification of gene specific primers in a single reaction. The specific biomarkers used in the study, were parathyroid hormone related protein (PTHrP), cytokeratin 19 (CK19), lung-specific X protein (LUNX) and gastrin releasing propeptide (preproGRP). GAPDH was used as internal control of the experimental process. The application of this method on cancer cell lines and healthy donors’ peripheral blood, determined the sensitivity and specificity of the assay. The decision to coamplify more than one biomarker, increases the sensitivity of the assay. Moreover, statistical analysis of the results, correlated the detection of CTC with residual cancer disease and specific sites of metastasis formation. The aforementioned method, supplements the current imaging and diagnostic techniques, but cannot substitute them.

Η διασπορά της νεοπλασματικής νόσου είναι η πρώτη αιτία θανάτου μεταξύ των ασθενών με βρογχογενή καρκίνο. Δεδομένα που προκύπτουν από πρόσφατες μελέτες, υποδεικνύουν ότι ακόμη και σε αρχικά στάδια εξέλιξης της νόσου, τα καρκινικά κύτταρα διασπείρονται και προκαλούν σε μεταγενέστερη φάση την εξέλιξη της νόσου. Τα καρκινικά κύτταρα, που απελευθερώνονται από την πρωτοπαθή εστία στην κυκλοφορία του αίματος, καλούνται κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (CTC-circulating tumor cells). Αυτά τα κύτταρα, έχουν τη δυνατότητα να ταξιδέψουν αιματογενώς και να εγκατασταθούν σε νέες θέσεις, δημιουργώντας εστίες μετάστασης, χωρίς να μπορούν να ανιχνευθούν από τις συμβατικές απεικονιστικές μεθόδους. Η ανίχνευση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα, αποτελεί ένα υποσχόμενο εργαλείο για την ανίχνευση υπολειπόμενης νόσου. Η χρήση τους θα δώσει επικουρικές πληροφορίες ως προς τον κίνδυνο να παρουσιάσει κάποιος ασθενής μεταστατική νόσο, ή να υποτροπιάσει μετά από τη θεραπεία. Επίσης, έχει εφαρμογή στην παρακολούθηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία, τόσο για να ελεγχθεί η επιτυχία της όσο και για να τερματιστεί σε περίπτωση αναποτελεσματικότητας, ώστε να περιοριστούν περαιτέρω παρενέργειες, να μην χαθεί χρόνος και να μειωθούν τα περιττά κόστη. Η έγκαιρη διάγνωση, η ακριβής σταδιοποίηση και η κατάλληλη θεραπευτική αντιμετώπιση, αποτελούν τις προϋποθέσεις για καλή πρόγνωση της νόσου. Η χρήση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων ως προγνωστικό ή διαγνωστικό δείκτη, θα βοηθήσει στη λήψη αποφάσεων, που θα επιμηκύνουν το προσδόκιμο ζωής των ασθενών. Δυστυχώς, τα πρωτόκολλα που εφαρμόζονται διεθνώς από τους ογκολόγους, δεν περιλαμβάνουν τη χρήση των CTC στην κλινική ρουτίνα, κυρίως γιατί δεν υπάρχουν τυποποιημένα, αξιόπιστα πρωτόκολλα. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η ανάπτυξη μίας τεχνικής μη επεμβατικής, εύκολης, γρήγορης κι ευαίσθητης, για την ανίχνευση των CTC στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα, που δεν θα χρησιμοποιείται για τη διάγνωση του καρκίνου, αλλά για τη βελτίωση της κλινικής σταδιοποίησής τους. Η τεχνική της πολλαπλής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Multiplex PCR), πλεονεκτεί έναντι της κλασσικής PCR, αφού πολλαπλασιάζονται ταυτόχρονα περισσότερα από ένα τμήματα γονιδίων, με την χρήση περισσότερων ζευγών εκκινητών, στην ίδια αντίδραση. Τα γονίδια-δείκτες που μελετήθηκαν είναι το πεπτίδιο που ομοιάζει με την παραθορμόνη (PTHrP), η κυτοκερατίνη 19 (CK19), η ειδική για τον πνεύμονα πρωτεΐνη Χ (LUNX) και το προπεπτίδιο της γαστρίνης (preproGRP). Ως εσωτερικός μάρτυρας του πειράματος χρησιμοποιήθηκε ο δείκτης γλυκεραλδεΰδη-3-φωσφωρική δεϋδρογονάση GAPDH. Η μέθοδος εφαρμόστηκε σε κυτταρικές σειρές για να καθοριστεί η ευαισθησία της και σε υγιή άτομα για να ελεγχθεί η ειδικότητά της. Όπως προέκυψε μετά από την στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων, η επιλογή να πολλαπλασιάσουμε περισσότερους από έναν, μοριακούς δείκτες, αύξησε την ευαισθησία ανίχνευσης των CTC, ενώ οι πληροφορίες δεν αφορούσαν μόνο στην παρουσία μικρομεταστατικής νόσου, αλλά και στην πιθανή θέση ανάπτυξης των μεταστάσεων. Η παραπάνω τεχνική, συμπληρώνει και σε καμία περίπτωση δεν υποκαθιστά, τις παραδοσιακές απεικονιστικές και διαγνωστικές μεθόδους.