Μελέτη ανάπτυξης μοντέλων αξιολόγησης δομής-δραστικότητας νέων μεταλλοφαρμάκων βαναδίου και ψευδαργύρου με βάση μοριακούς βιοδείκτες ινσουλινομίμησης στο διαβήτη τύπου ΙΙ

Abstract

Diabetes mellitus (DM) encompasses a group of metabolic syndromes, with a common characteristic being high blood glucose levels. Hyperglycemia emerges as the ultimate phenotypic symptom, following a series of pathological processes related directly or indirectly to the inability or failure to produce insulin. Based on the known pathogenicity of the disease, DM can be either insulin-dependent (DM 1) or insulin-independent (DM 2). DM2 covers approximately 90% of the diagnosed cases worldwide. The currently administered therapeutic protocols, dealing with the disease symptoms, have several disadvantages pertaining to a) elevated oxidative stress in patients exogenously receiving insulin, with a concomitant diminution of their standard of living, and b) a plethora of side-effects from insulin substitutes. The rapid rise of the disease worldwide, the extent and severity of complications emerging in all human physiological systems-organs-tissues, in combination with the lack of effectiveness of contemporary therapeutic drugs, raise an immediate need for new insulin mimetic pharmaceuticals. Especially intimate is the relationship between DM and obesity, both closely associated with adipose tissue, which stores energy in the form of triglycerides and releases free fatty acids, while concurrently acting as an endocrine organ. Furthermore, adipose tissue accumulation, against obesity, is linked to tolerance observed toward insulin. In this respect, the goal of the present study was to evaluate the action of known insulin mimetic metal ions in the insulin metabolic pathway, with emphasis in lipogenesis (adipogenesis), which reflects the main insulin form of activity. The development of potential such pharmaceuticals, capable of inducing pre-adipocyte adipogenesis toward mature adipocytes, rides on the design of metal-organic forms of metal ions Ζn(II), V(IV,V) and Cr(III), with appropriate structurally configured organic substrates, capable of inducing differentiation of their physicochemical properties at the biological level.Zinc is an endogenous trace element, participating in numerous intracellular processes, such as the synthesis and excretion of insulin, the induction of intracellular glucose uptake, while it has been shown that it acts at various points along the signaling pathway activated by insulin. It is not, however, yet fully delineated a) what the role is for zinc mimicking or replacing insulin activity, and b) what the correlation is between the nature of zinc form(s) in relation to the bioactivity it exhibits. Chromium has been shown to play a central role in the metabolism of hydrocarbons, enhancing insulin activity and thus sensitivity toward that hormone, ultimately serving long term therapeutic approaches for DM 2. Vanadium has been described as a non-essential nutritional supplement and an agent necessary in minute amounts, with no however known physiological role of that trace element in humans. Its mechanism of action toward glycemic control is primarily linked to that of insulin, but through re-adjustment of insulin receptors. To that end, plenty of work has been carried out to pursue understanding of the relationship between vanadium and DM, in view of the fact that vanadium mimicks the majority of the immediate effects of insulin, such as glucose uptake and activation of its catabolic pathways.For that reason, a) especially configured organic ligand binders, and b) a family of well-defined complex compounds of Ζn(II), V(IV,V) and Cr(III) have been designed, synthesized and characterized physicochemically (X-ray crystallography, analytical techniques, NMR spectroscopy, FT-IR, TGA-DTG, ESI-MS, etc.). For the structure-dependent and metal-dependent biological investigation of the newly synthesized complex forms of Ζn(II), V(IV,V) and Cr(III) the adipose tissue cell line 3T3-L1 was used, through which careful evaluation took place of a) the (a)toxicity behavior of the title materials, b) the adipogenic potential, and c) the extent of influence in the expression of genes directly or indirectly related to the cellular differentiation (PPAR-γ) and the intracellular glucose uptake (GLUT 1, 4), and d) the expression of glucokinase and adiponectin genes. The results a) show a clear structure-biological activity relationship (cellular survival, migration, adipogenesis) of the discrete forms of Ζn(II), V(IV,V) and Cr(III), and b) set the grounds for the development of molecular technology fighting hyperglycemia through atoxic, bioavailable active forms of Ζn(II), V(IV,V) and Cr(III).Further research into the broader field of peripheral neuropathy and neurotoxicity led to the central nervous system (CNS) and the peripheral nervous system (PNS). They are two especially sensitive tissues, in view of their vulnerability to a plethora of stress factors. In this case, specific metal ions were examined, endogenous or exogenous, potentially toxic to the nervous system as a function of their concentration or the extent of disruption of their homeostasis. For the evaluation of the activity of such metal ionic forms (cobalt, cerium, aluminum, chromium, copper as well as anticancer drugs based on platinum) a model system was employed, encompassing isolated rat sciatic nerves (ex vivo). The model is based on the correlation between viability and action potential generation from stimulated nerve fibers. Nerve viability evaluation can be run through generation of Compound Action Potentials (CAP). In vitro evaluation of metal ionic action was carried out in primary hippocampal cells. Initial evaluation of the potential toxicity action on behalf of the studied metal ionic compounds took place at high concentrations (500 μΜ). The results show that Fe(III) and Al(III) are not toxic, given that CAP is not affected throughout the duration of the experiments. In addition, Co(III) and Ce(III) do not seem to influence significantly the viability of the nerve fibers. On the other hand, Cu(II) and Cr(VI) lower significantly the viability of nerve fibers in a dose-dependent fashion. This observation is tentatively attributed to the production of ROS, in view of the fact that both metal ions are redox active. Moreover, the potential neuroprotective action of n-acetyl cysteine (NAC) and the chelator EDTA was also examined. The results show clearly the neuroprotective role of EDTA, whereas NAC has no influence on the copper-induced toxicity. Finally, the anticancer drugs oxaliplatin and cis-platin seem to influence the potassium voltage-gated channels, in view of the fact that secondary repolarization phases emerge prominently.Collectively, the structure- and metal-dependent behavior of the newly-arisen metal ionic compounds in clinically demanding pathologies reflect on the existence of specific physicochemical characteristics of the organic substrates which, when present, influence profusely the biological activity of the metal ions (DM and peripheral neuropathy). The discoveries in this field of research, through the present doctoral thesis, shed light onto key aspects of clinically important conditions and proffer merit toward further research and employment of safe metallodrugs against aberrational cellular processes in human physiology.

Ο Σακχαρώδης Διαβήτης (ΣΔ) αντιπροσωπεύει ομάδα μεταβολικών νοσημάτων με κοινό χαρακτηριστικό τα υψηλά επίπεδα γλυκόζης στο αίμα. Η υπεργλυκαιμία εμφανίζεται ως το καταληκτικό χαρακτηριστικό μετά από μια σειρά παθολογικών καταστάσεων που σχετίζονται άμεσα ή έμμεσα με την αδυναμία ή\και ανεπάρκεια παραγωγής της ινσουλίνης. Με βάση την αιτιοπαθογένεια της νόσου, ο ΣΔ διακρίνεται κυρίως σε ινσουλινο-εξαρτώμενο (Διαβήτης τύπου 1) και μη (Διαβήτης τύπου 2). Ο διαβήτης τύπου 2 αντιστοιχεί περίπου στο 90% των διαγνωσμένων περιπτώσεων παγκοσμίως. Τα θεραπευτικά πρωτόκολλα που ακολουθούνται για τη θεραπεία των συμπτωμάτων της νόσου παρουσιάζουν αρκετά μειονεκτήματα, τα οποία αφορούν α) στο αυξημένο stress ασθενών που λαμβάνουν εξωγενώς ινσουλίνη, με αποτέλεσμα την υποβάθμιση της ποιότητας ζωής τους, και β) σε πληθώρα παρενεργειών από τα υποκατάστατα ινσουλίνης. Η ραγδαία αύξηση της νόσου, η έκταση και η σοβαρότητα των επιπλοκών που εμφανίζονται σχεδόν σε όλα τα συστήματα του οργανισμού, σε συνδυασμό με την έλλειψη αποτελεσματικότητας των σημερινών θεραπευτικών παραγόντων, εγείρουν την ανάγκη για εύρεση νέων ινσουλινομιμητικών φαρμάκων. Ιδιαίτερα πιθανή σύνδεση μεταξύ του ΣΔ και της παχυσαρκίας αποτελεί ο λιπώδης ιστός, ο οποίος αποθηκεύει ενέργεια με τη μορφή τριγλυκεριδίων και απελευθερώνει ελεύθερα λιπαρά οξέα, ενώ παράλληλα δρα ως ενδοκρινές όργανο. Επιπλέον, η συσσώρευση του λιπώδους ιστού, κατά την παχυσαρκία, σχετίζεται με την ανοχή που παρατηρείται στην ινσουλίνη. Στο πλαίσιο αυτό, στόχος της παρούσας μελέτης αποτέλεσε η αξιολόγηση της δράσης γνωστών ινσουλινομιμητικών μεταλλοϊόντων στο μεταβολικό μονοπάτι της ινσουλίνης με έμφαση στη λιπογένεση (αδιπογένεση), η οποία αποτελεί κύρια δράση της ινσουλίνης. Η ανάπτυξη εν δυνάμει μεταλλοφαρμάκων ικανών να προκαλέσουν αδιπογένεση προ-λιποκυττάρων σε ώριμα λιποκύτταρα στηρίζεται στο σχεδιασμό μεταλλο-οργανικών μορφών των μεταλλοϊόντων Ζn(II), V(IV,V) και Cr(III) με κατάλληλα δομικά διαμορφωμένα οργανικά υποστρώματα που επάγουν διαφοροποίηση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων τους σε βιολογικό επίπεδο. Ο ψευδάργυρος αποτελεί ενδογενές ιχνοστοιχείο, το οποίο συμμετέχει σε πολυάριθμες ενδοκυττάριες διεργασίες, όπως η σύνθεση και έκκριση ινσουλίνης, στην επαγωγή ενδοκυττάριας πρόσληψης της γλυκόζης, ενώ έχει δειχθεί ότι δρα σε διάφορα σημεία του σηματοδοτικού μονοπατιού που ενεργοποιείται από την ινσουλίνη. Ωστόσο, δεν είναι ακόμα πλήρως αποσαφηνισμένος ο α) τρόπος με τον οποίο ο ψευδάργυρος μιμείται ή αντικαθιστά τη δράση της ινσουλίνης καθώς, και β) βαθμός συσχέτισης της μορφής του ψευδαργύρου σε σχέση με τη βιοδραστικότητα που επιδεικνύει. Το χρώμιο έχει δειχθεί ότι επιτελεί κεντρικό ρόλο στο μεταβολισμό των υδατανθράκων, ενισχύοντας τη δράση της ινσουλίνης και άρα την ευαισθησία σε αυτή, με αποτέλεσμα τη μακροχρόνια θεραπεία του σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2. Το βανάδιο έχει περιγραφεί τόσο ως μη απαραίτητο θρεπτικό συστατικό όσο και ως συστατικό το οποίο απαιτείται σε πάρα πολύ μικρές ποσότητες και δεν έχει βρεθεί ακόμη κάποιος φυσιολογικός ρόλος του ως ιχνοστοιχείου στον άνθρωπο. O μηχανισμός δράσης του βαναδίου στον γλυκαιμικό έλεγχο σχετίζεται αρχικά με αυτόν της ινσουλίνης, αλλά και με την επαναρρύθμιση των υποδοχέων της ινσουλίνης. Πολυάριθμες έρευνες έχουν διεξαχθεί με σκοπό την κατανόηση της σχέσης μεταξύ βαναδίου και ΣΔ, καθώς έχει δειχθεί ότι το βανάδιο μιμείται την πλειοψηφία των άμεσων επιδράσεων της ινσουλίνης, όπως είναι η πρόσληψη της γλυκόζης και η ενεργοποίηση μονοπατιών καταβολισμού της.Για το σκοπό αυτό, σχεδιάστηκαν, συντέθηκαν και χαρακτηρίστηκαν φυσικοχημικά (κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ, αναλυτικές τεχνικές, φασματοσκοπίες NMR, FT-IR, TGA-DTG, ESI-MS, κ.ά.) α) ειδικά δομημένοι οργανικοί υποκαταστάτες, και β) μια οικογένεια από καλώς καθορισμένες σύμπλοκες ενώσεις [Ζn(II), V(IV,V) και Cr(III)]. Για τη διερεύνηση της δομο-εξαρτώμενης και μεταλλο-εξαρτώμενης βιολογικής δραστικότητας των νεοσυντιθέμενων μορφών (Ζn(II), V(IV,V) και Cr(III)) χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά λιπώδους ιστού, 3Τ3-L1, όπου πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση του α) (α)τοξικού χαρακτήρα των υπό μελέτη υλικών, β) αδιπογενετικού δυναμικού, γ) βαθμού επιρροής στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται άμεσα ή έμμεσα με την κυτταρική διαφοροποίηση (PPAR-γ) και την ενδοκυττάρια πρόσληψη γλυκόζης (GLUT 1, 4), και 4) την έκφραση των γονιδίων της γλυκοκινάσης και αδιπονεκτίνης. Τα αποτελέσματα α) υποδεικνύουν σαφή σχέση δομής-βιολογικής δραστικότητας (κυτταρική επιβίωση, μεταναστευτικότητα, αδιπογένεση) των διακριτών μορφών Ζn(II), V(IV,V) και Cr(III), και β) θέτουν τα θεμέλια για την ανάπτυξη μοριακής τεχνολογίας αντιμετώπισης της υπεργλυκαιμίας μέσω ατοξικών, βιοδιαθέσιμων δραστικών μορφών Ζn(II), V(IV,V) και Cr(III).Περαιτέρω έρευνα στο ευρύτερο πεδίο περιφερικής νευροπάθειας και νευροτοξικότητας οδήγησε στο κεντρικό νευρικό (ΚΝΣ) και περιφερικό νευρικό (ΠΝΣ) σύστημα. Πρόκειται ιδιαίτερα ευάλωτους ιστούς, καθώς είναι εύκολα προσβάσιμοι σε πληθώρα καταπονητικών παραγόντων. Στην περίπτωση αυτή εξετάσθηκαν συγκεκριμένα μεταλλοϊόντα, ενδογενή ή μη, εν δυνάμει τοξικά για το νευρικό σύστημα ως συνάρτηση της συγκέντρωσής τους ή κατά τη διατάραξη της ομοιόστασής τους. Για την αξιολόγηση της επίδρασης των μεταλλοϊόντων αυτών (κοβάλτιο, δημήτριο, αργίλιο, χρώμιο, χαλκός καθώς και αντικαρκινικά φάρμακα με βάση το λευκόχρυσο) χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο του απομονωμένου ισχιακού νεύρου των θηλαστικών (επίμυες ex vivo). Το μοντέλο βασίζεται στο συσχετισμό της βιωσιμότητας με τη γένεση δυναμικών δράσης από διεγερμένες νευρικές ίνες. Η αξιολόγηση της βιωσιμότητας πραγματοποιείται μέσω της παραγωγής Σύνθετου Δυναμικού Ενέργειας (ΣΔΕ). H in vitro αξιολόγηση της δράσης των μεταλλοϊόντων πραγματοποιήθηκε σε πρωτογενείς καλλιέργειες ιπποκαμπιαίου ιστού. Η αρχική αξιολόγηση της ενδεχόμενης τοξικής δράσης των υπό μελέτη μεταλλοϊοντικών ενώσεων έγινε σε υψηλές συγκεντρώσεις (500 μΜ). Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι ο Fe(III) και το Al(III) δεν είναι τοξικά, καθόσον το ΣΔΕ ενέργειας δεν επηρεάζεται καθ’ όλη τη διάρκεια του πειράματος. Επιπλέον, το Co(II) και το Ce(III) φαίνεται να μην επηρεάζουν ιδιαίτερα τη βιωσιμότητα των νευρικών ινών. Αντίθετα, ο Cu(II) και το Cr(VI) μειώνουν σημαντικά τη βιωσιμότητα των νευρικών ινών με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η παρατήρηση αυτή αποδίδεται στην παραγωγή ROS, δεδομένου ότι αμφότερα μεταλλοϊόντα είναι οξειδοαναγωγικά ενεργά. Επιπρόσθετα, αξιολογήθηκε η ενδεχόμενη νευροπροστατευτική δράση των ενώσεων Ν-ακετυλ-κυστεΐνη (NAC) και του χηλικοποιητικού μορίου EDTA. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν σαφή νευροπροστατευτική δράση του EDTA, ενώ η NAC δεν έχει καμία επίδραση στην προκαλούμενη από το χαλκό τοξικότητα. Τα ίδια αποτελέσματα προκύπτουν και από την in vitro αξιολόγηση. Τέλος, τα αντικαρκινικά οξαλιπλατίνα και cis-πλατίνη φαίνεται να επηρεάζουν τα τασεοελεγχόμενα κανάλια καλίου καθώς εμφανίζονται δευτερογενείς επαναπολωτικές φάσεις. Συνολικά, η δομο- και μεταλλο-εξαρτώμενη συμπεριφορά των νεοσυντιθέμενων ενώσεων σε κλινικά απαιτητικές παθολογίες αντικατοπτρίζουν την ύπαρξη συγκεκριμένων φυσικοχημικών χαρακτηριστικών των οργανικών υποστρωμάτων που όταν είναι παρόντα επηρεάζουν ουσιαστικά τη βιολογική δραστικότητα των μεταλλοϊόντων (ΣΔ και περιφερική νευροπάθεια). Οι ανακαλύψεις στο πεδίο αυτό μέσω της παρούσας διδακτορική διατριβής φέρουν στο φως ουσιαστικές γνώσεις που προσφέρουν προοπτική για περαιτέρω έρευνα και χρήση ασφαλών μεταλλοφαρμάκων για την αντιμετώπιση αποκλινουσών κυτταρικών διεργασιών στην ανθρώπινη φυσιολογία.