Σύνθεση νανοφορέων για στοχευμένη μεταφορά αντιγόνων σε δενδριτικά κύτταρα

Abstract

The present doctoral thesis focuses on the synthesis of nanocarriers for the targeted antigens and adjuvants delivery to dendritic cells, through vaccination. The nanocarriers synthesized for this purpose are poly(lactic-glycolic) acid (PLGA) nanoparticles, solid lipid nanoparticles with lipids in combinations of two (stearic-palmitic acid, stearic-lauric acid, palmitic-lauric acid), and poly(acrylic) acid-poly(allylamine) (PAA-PAH) complexes. The synthesis of PLGA nanoparticles is achieved with the double emulsion/ solvent evaporation method. The PLGA nanoparticles have a multitude of applications in the field of nanomedicine for the treatment of a large number of diseases, due to their biocompatibility with the human body and their biodegradability. Firstly, the synthesis of PLGA nanoparticles was carried out. These PLGA nanoparticles carry model antigen and Leishmania antigens, the MPLA adjuvant and targeting moiety (TNF-α, Tumor Necrosis Factor), which are recognized by dendritic cells. Subsequently, a study of their physicochemical properties, as well as a stability study and cytotoxicity study, were carried out. Additionally, the empirical model which simulates the antigen and adjuvant's release mechanism from the PLGA nanoparticles, was calculated. Furthermore, the in vivo mouse inoculation experiments with PLGA nanoparticles produced encouraging results for the induction of immunity against the disease. The synthesis of solid lipid nanoparticles (stearic-palmitic acid, stearic-lauric acid, palmitic-lauric acid) is achieved with the double emulsion/ reverse micelle method. The solid lipid nanoparticles are characterized by a high level of biocompatibility and low levels of toxicity, due to the presence of physiological lipids, which are also found in the human body. During the course of the study, the model antigen BSA-FITC was encapsulated and an investigation of the optimal synthesis conditions of stearic-palmitic acid nanoparticles was carried out. Subsequently, two other lipid combinations (stearic-palmitic acid and palmitic-lauric acid) were examined regarding the encapsulation of model antigen, as well as with respect to their stability as antigen carriers. Moreover, a simulation study of antigen release kinetics from the aforementioned solid lipid nanoparticles was carried out. Furthermore, the synthesis of poly(acrylic) acid – poly(allylamine) complexes took place with the ionic complexation of poly(acrylic) acid (anionic charged) and poly(allylamine) (cationic charged) method. The polyelectrolyte complexes are characterized by biocompatibility, absence of toxicity and biodegradability potential, characteristics which render them an important tool for the transfer of active substances. During the course of the study, the complexation of the model antigen BSA-FITC and the MPLA adjuvant with the aforementioned polyelectrolytes and conjugation of the PNA targeting moiety (lectin from Arachis hypogaea) on the complex carried out. Subsequently, the stability of the complexes during their storage was studied and the kinetic model which simulates the antigen and adjuvant release process was calculated.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματεύεται τη σύνθεση νανοφορέων για τη στοχευμένη χορήγηση αντιγόνων και ανοσοενισχυτικών στα δενδριτικά κύτταρα, μέσω εμβολιασμού. Οι νανοφορείς που συντίθενται για το στόχο αυτό είναι τα νανοσωματίδια πολυ(γαλακτικου-γλυκολικού) οξέος, τα νανοσωματίδια στερεών λιπιδίων με ανά δύο συνδυασμούς λιπιδίων (στεατικού, παλμιτικού, λαουρικού οξέος) και τα σύμπλοκα πολυηλεκτρολυτών πολυ(ακρυλικου) οξέος - πολυ(αλλυλαμίνης). Η σύνθεση νανοσωματιδίων πολυ(γαλακτικου-γλυκολικού) οξέος πραγματοποιείται με την τεχνική διπλού γαλακτώματος/ εξάτμισης διαλύτη. Τα νανοσωματίδια πολυ(γαλακτικου-γλυκολικού) οξέος βρίσκουν πολυάριθμες εφαρμογές στη νανοϊατρική για τη θεραπεία ενός μεγάλου αριθμού νόσων, εξαιτίας της βιοσυμβατότητας τους με τον ανθρώπινο οργανισμό και της βιοαποικοδομήσιμοτητας τους. Πραγματοποιήθηκε σύνθεση νανοσωματιδίων πολυ(γαλακτικου-γλυκολικού) οξέος που φέρουν μοντέλο αντιγόνου και αντιγόνα λεϊσμανίασης, το ανοσοενισχυτικό MPLA και το μόριο στόχευσης των δενδριτικών κυττάρων TNF-α (Tumor Necrosis Factor), που αναγνωρίζονται από τα δενδριτικά κύτταρα. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκε μελέτη των φυσικοχημικών τους χαρακτηριστικών, μελέτη της κινητικής της απελευθέρωσης των αντιγόνων και του ανοσοενισχυτικού από τα νανοσωματίδια πολυ(γαλακτικου-γλυκολικού) οξέος όπως επίσης, μελέτη σταθερότητας και κυτταροτοξικότητας. Επιπλέον, τα in vivo πειράματα εμβολιασμού ποντικών με νανοσωματίδια PLGA, έδωσαν ενθαρρυντικά αποτελέσματα για την επαγωγή προστασίας έναντι της νόσου. Η σύνθεση νανοσωματιδίων στερεών λιπιδίων (στεατικού, παλμιτικού, λαουρικού οξέος) πραγματοποιείται με τη μέθοδο διπλού γαλακτώματος/ ανάστροφων μικυλίων. Τα νανοσωματίδια στερεών λιπιδίων χαρακτηρίζονται από υψηλή βιοσυμβατότητα και χαμηλά επίπεδα τοξικότητας, εξαιτίας της παρουσίας των φυσιολογικών λιπιδίων, τα οποία απαρτίζουν τον ανθρώπινο οργανισμό. Κατά τη διάρκεια της μελέτης, ενσωματώθηκε το μοντέλο αντιγόνου BSA-FITC και πραγματοποιήθηκε διερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών σύνθεσης των νανοσωματιδίων στεατικού-παλμιτικού οξέος. Στη συνέχεια, εξετάστηκαν δύο άλλοι συνδυασμοί λιπιδίων (στεατικού-λαουρικού και παλμιτικού-λαουρικού οξέος) ως προς τον εγκλεισμό του μοντέλου αντιγόνου αλλά και ως προς τη σταθερότητά τους, ως φορείς αντιγόνων. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε μελέτη κινητικής της απελευθέρωσης του αντιγόνου από τα εν λόγω, νανοσωματίδια στερεών λιπιδίων. Επιπλέον, η σύνθεση συμπλόκων πολυ(ακρυλικου) οξέος - πολυ(αλλυλαμινης) έλαβε χώρα με τη μέθοδο ιοντικής συμπλοκοποίησης του ανιονικά φορτισμένου πολυ(ακρυλικου) οξέος και της κατιονικά φορτισμένης πολυ(αλλυλαμινης). Τα σύμπλοκα πολυηλεκτρολυτών χαρακτηρίζονται από βιοσυμβατότητα, απουσία τοξικότητας και δυνατότητα βιοαποικοδόμησης, χαρακτηριστικά που τους καθιστούν σημαντικό εργαλείο για τη μεταφορά ενεργών ουσιών. Κατά τη διάρκεια της μελέτης, ενσωματώθηκε το μοντέλο αντιγόνου BSA-FITC, το ανοσοενισχυτικό MPLA και το μόριο στόχευσης των δενδριτικών κυττάρων, PNA (λεκτίνη-αγλουτινίνη από το Arachis hypogaea). Εν συνεχεία, μελετήθηκε η σταθερότητα των συμπλόκων κατά την αποθήκευσή τους και η κινητική απελευθέρωσης του αντιγόνου και του ανοσοενισχυτικού.