Genetic and epigenetic regulatory networks in mouse embryonic stem cells

Abstract

In the past decade, numerous studies demonstrated that both microRNAs (miRNAs) and Promyelocytic Leukemia Protein (PML) were central regulators of different biological processes including cell proliferation, apoptosis and tumorigenesis. Emerging research links miRNAs as well as PML with the regulation of stem cells maintenance. Several miRNAs were reported to sustain embryonic stem cells (ESCs) identity (miR-290-295), while others to induce ESC differentiation (miR-34a, miR-145). At the same time, recent reports using p19 embryonal carcinoma cells and ESCs showed that Nanog and Oct4 – the core pluripotent regulators - associate with PML protein. Moreover, PML was described as a regulator of metabolic pathways in stem cell compartments (hematopoietic stem cells-HSCs) and as an essential component in leukemia-initiating cells maintenance. In an effort to elucidate the molecular mechanism underlying the contribution of PML and miRNAs in stemness phenotype, we examined their role in mESCs.In the first part of this work, we present four new miRNAs (miR-16-1, miR-191, miR-23a, miR-421), which are differentially expressed upon differentiation. miR-191 and miR-16-1 are highly expressed in ESCs and inhibits Activin-Nodal signaling, leading to the suppression of mesoderm and endoderm differentiation. miR-23a, which is also down-regulated in the differentiated state, represses differentiation towards the endoderm and ectoderm lineages. In contrast, miR-421 was characterized as a differentiation-associated regulator that targets the core pluripotency transcription factor Oct4 and the BMP-signaling pathway to promote endoderm and ectoderm differentiation. Our results uncover a regulatory network between the studied miRNAs and both branches of TGF-β/BMP signaling pathways unveiling their importance for ESC lineage decisions. In the second part of this thesis, we show that PML positively correlates with the undifferentiated state and is a vital regulator of ESC pluripotency. PML knockdown induces up-regulation of multi-lineage differentiation markers and produces enhanced differentiation towards mesodermal lineage, while ectopic expression of PML prevents ESC differentiation in vitro and maintains stem cell phenotypes. Through transcriptome analysis of ESCs WT and ESC PML KD, we identified a large number of differentially expressed genes. Specifically, a group of deregulated genes is involved to the transition from naïve to primed pluripotent state, while a great number of genes associate with both signaling pathways essential for ESC identity as well as cell cycle. Additionally, reprogramming of Pml-/-mouse embryonic fibroblasts (MEFs) showed significantly lower efficiency compared to MEFs WT, highlighting PML as a pivotal mediator of somatic cell reprogramming. We speculate that the potential mechanism is based on regulation of EMT through TGF-β signaling. Our findings reveal that PML acts as an essential regulator in naïve and primed pluripotency as well as somatic cell reprogramming.

Τα τελευταία χρόνια, πληθώρα ερευνητικών εργασιών κατέδειξε ότι τόσο τα μικρά-RNAs όσο και η πρωτεΐνη προμυελοκυταρικής λευχαιμίας (ΠΠΛ) διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο σε πολλές κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης και της ογκογένεσης. Παράλληλα, ο ρόλος τους έχει συσχετιστεί με τη ρύθμιση των βλαστικών κυττάρων. Συγκεκριμένα, έχει δειχθεί ότι πολλά μικρά-RNAs συμβάλουν στη διατήρηση των εμβρυικών βλαστικών κυττάρων (ΕΒΚ) (miR-290-295), ενώ άλλα προάγουν τη διαφοροποίηση αυτών (miR-34a, miR-145). Επιπρόσθετα, έρευνες με τη χρήση κυττάρων εμβρυικού καρκινώματος και ΕΒΚ ανέδειξαν την αλληλεπίδραση δύο βασικών ρυθμιστών της πλειοδυναμίας -Oct4 και Nanog- με τη ΠΠΛ, η οποία με τη σειρά της έχει χαρακτηρισθεί ως ρυθμιστής των μονοπατιών μεταβολισμού σε βλαστικά συστήματα (αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα) και ως βασικό στοιχείο της διατήρησης των λευχαιμικών αρχέγονων κυττάρων. Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως στόχο τη κατανόηση του μοριακού μηχανισμού ρύθμισης των ΕΒΚ τόσο από τα μικρά-RNAs όσο και από τη ΠΠΛ.Στο πρώτο μέρος της διατριβής, παρουσιάζονται 4 νέα μικρά-RNAs (miR-16-1, miR-191, miR-23a, miR-421), τα οποία εκφράζονται ποικιλοτρόπως κατά τη διαφοροποίηση. Συγκεκριμένα, τα miR-16-1 και miR-191 εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα στα ΕΒΚ και καταστέλλουν το σηματοδοτικό μονοπάτι Activin-Nodal, παρεμποδίζοντας τη μεσοδερμική και ενδοδερμική διαφοροποίηση. Το miR-23a, του οποίου η έκφραση μειώνεται σημαντικά κατά τη διαφοροποίηση, μετριάζει τη κατεύθυνση προς την ενδοδερμική και εκτοδερμική στιβάδα. Αντίθετα, το miR-421 στοχεύει το βασικό παράγοντα πλειοδυναμίας, Oct4, καθώς και στοιχεία του BMP σηματοδοτικού μονοπατιού, Smad5 and Id2, καθιστώντας το ως ρυθμιστή της διαφοροποίησης των ΕΒΚ. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ένα νέο μηχανισμό αλληλεπίδρασης μεταξύ των παραπάνω μικρών-RNAs και των δύο κλάδων του TGF-β μονοπατιού, τονίζοντας τη σημαντικότητά τους σε αποφάσεις-κλειδιά για τη μοίρα των βλαστικών κυττάρων. Στο δεύτερο μέρος της ερευνητικής εργασίας, μελετήθηκε και συσχετίστηκε ο ρόλος της ΠΠΛ με την αδιαφοροποίητη κατάσταση των ΕΒΚ. Συγκεκριμένα, η αποσιώπηση της ΠΠΛ οδηγεί στην επαγωγή παραγόντων διαφοροποίησης των τριών βλαστικών στιβάδων και ενισχύει τη μεσοδερμική κατεύθυνση, ενώ αντίθετα η υπερέκφρασή της παρεμποδίζει τη διαφοροποίηση και διατηρεί το φαινότυπο των ΕΒΚ. Με τη χρήση μικροσυστοιχιών έκφρασης σε ΕΒΚ παρουσία και απουσία της ΠΠΛ, βρέθηκαν εκτεταμένες αλλαγές στο πρότυπο γονιδιακής έκφρασης. Μια ομάδα αυτορυθμιζόμενων γονιδίων εμπλέκεται στη μετάβαση από την αρχέγονη πλειοδύναμη στην ενεργοποιημένη-όψιμη κατάσταση επιβλάστης, ενώ μια άλλη σχετίζεται με τον κυτταρικό κύκλο και τα σηματοδοτικά μονοπάτια που εμπλέκονται στα ΕΒΚ. Επιπρόσθετα, ο επαναπρογραμματισμός ινοβλαστών από έμβρυο ποντικού με αποσιωπημένη τη ΠΠΛ δεν ήτανε επιτυχής, επισημαίνοντας ότι η ΠΠΛ είναι αναγκαία για την ολοκλήρωση της διαδικασίας. Ο πιθανός προτεινόμενος μηχανισμός δράσης της ΠΠΛ στον επαναπρογραμματισμό βασίζεται στη ρύθμιση της επιθηλιακής-μεσεγχυματικής μετάβασης μέσω του TGF-β μονοπατιού. Τα στοιχεία αυτά αποκαλύπτουν ότι η ΠΠΛ διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο τόσο στη πλειοδυναμία των ΕΒΚ όσο και στον επαναπρογραμματισμό σωματικών κυττάρων.