Πολυμορφισμός των HLA Ταξης I-II γονιδίων στους Πομάκους της Ανατολικής Θράκης

Abstract

OBJECTIVE: The Major Histocompatibility Complex (MHC) in humans is located on the short arm of chromosome 6 and is called the Human Leucocyte Antigen (HLA) complex. Both HLA class I and class II molecules consist of heterodimeric cell surface glycoproteins that play an important role in immune recognition and in tissue matching for organ transplantation. The HLA system exhibits the most extensive polymorphism in any known human genome. Development of the PCR-based DNA typing methods has allowed the detailed analysis of polymorphism in the HLA genes and has revealed that there are many alleles, which could not be distinguished by either serological or cellular techniques. Anthropological studies have demonstrated that the distribution of HLA alleles differs from one ethnic group to another. Population-specific distribution of HLA alleles is necessary and interesting in population genetics, transplantation and in HLA disease association studies. Pomacs is a restricted population group, living at unequal parts in Greece and Bulgaria. Geographically the majority of them are living at an area that called Rodopi in Bulgaria, while in Greece they are scattered at the road axis of Xanthi and Komotini. The aim of this study is the investigation of the allele frequency of HLA class I genes in Pomaci for the first time by DNA methology and their relation to Greek, Bulgarian and Turkish population. MATERIAL AND METHODS The samples that were studied consisted of 126 unrelated, healthy Pomacs individuals, and 92 healthy, unrelated individuals of Greek origin. Genomic DNA was isolated from anticoagulated peripheral blood in 0.5% Na2EDTA using standard proteinase K digestion followed by salting out extraction and ethanol precipitation. Allelic polymorphism in HLA class I (A, - B, -C) genes were investigated by the PCR-SSP technique, and HLA class II (DRB1, DQB1) genes were investigated by Polymerase Chain Reaction—reverse dot blot. Allele frequency were estimated by using Brenstein formula GF=1-√1-AgF and genetic distance was estimated by using cavalli-sforza formula. D = 4(1- Cosθ)/k-1 όπου Cosθ = ∑√(GfiA)(GfiB)RESULTS At the HLA-A, -B and –C locus the most frequent alleles in Pomaci were: HLA-A*0201(41%), Α*0301(13%), Α*0101(12%), Α*2402(12%), και Α*2601(7.4%), Β*1801(21%), Β*5101(9.2%), Β*3501(9%), Β*4402(8.3%), Β*4403(7.4%) and Β* 0801(7.4%), C*0701(29%), C*0401(19%), C*1203(12%), C*0602(10%) and C*0202(9.6%). At the HLA-DRB1 and DQB1 locus the most frequent alleles in Pomaci were:HLA-DRB1: DRB1*1104(17.8%), DRB1*0701(11.8%), DRB1*0101(11.3%), DRB1*1501(10.4%) και DRB1*1601(8.7%).HLA-DQB1: DQB1*0301(38.3%), DQB1*02(19.4%) και DQB1* 0501(15%).On the contrary the most frequent alleles in Greeks were: Α*0201(23.2%), Α*2402(17.5%), Α*0301(12.3%) και Α*0101(12.3%), Β*5101(15.2%), Β*1801(14%) Β*3501(8.9%), C*0401(23.2%), C*0701(23.3%), C*1203(11.7%), C*0702(8.4%) και C*0202(8.4%). HLA-DRB1: DRB1*1104(18.6%), DRB1*1601(12.1%), DRB1*1101(8.4%), DRB1*(6.7%), DRB1*0101(5.6%) και DRB1*1501(5.6%).HLA-DQB1: DQB1*0301(31.7%), DQB1*0502(16.6%), DQB1*02(13.4%) και DQB1*0501(9.1%). The genetic distance between Pomaci and the other 3 populations were:.α. High resolution.POPULATION GROUPD.HLA-AD.HLA-BD.HLA-CD.HLA-DRB1D.HLA-DQBD.HLA-(A+B)D.HLA-(A+B+DR)POMACI-GREEKS0.2070.1140.2300.2010.4500.2920.475POMACI-BULGARIANS0.2240.123-0.185-0.3200.480.β. Low resolution. POPULATION GROUPD.HLA-AD.HLA-BD.HLA-DRB1D.HLA-(A+B)D.HLA-(A+B+DR)POMACI-TURKISH0.3710.200.4100.5020.837It should be mention that the HLA-typing for class I and class II for the Turkish population sample was done by using low-resolution, while the other populations samples were done by using high-resolution. CONCLUSION: The present study allows the first accurate description of distribution of HLA alleles in Pomaci and provides new information to the database of HLA frequencies in different populations in the world. The results can be used in diseases association’s studies and in transplantation. The immunogenetic profile of the Pomaci population is characteristic of Caucasian populations. The closest populations to Pomaci, estimated according to genetic distance are Bulgarian and Greek population and not Turkish population. This study suggests that Pomaci belong to Bulgarians and Greeks, and this is consistent with historical data and geographical location and mobility of the Pomaci throughout ages.

ΣΚΟΠΟΣ: Το Μείζον Σύμπλεγμα Ιστοσυμβατότητας του ανθρώπου (HLA), εντοπίζεται στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 6, υποδιαιρείται σε τρείς λειτουργικές υποπεριοχές, HLA τάξης Ι, ΙΙ και ΙΙΙ και αποτελεί το πλέον πολυμορφικό σύστημα που έχει διαπιστωθεί στο ανθρώπινο γένωμα. Τα προϊόντα των γονιδίων των HLA τάξης Ι και ΙΙ περιοχών είναι ετεροδιμερείς μεμβρανικές γλυκοπρωτεϊνες, οι οποίες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην έναρξη της ανοσιακής απάντησης και στην απόρριψη του μοσχεύματος κατά τις μεταμοσχεύσεις. Προσδιορισμός των HLA γονιδίων με εφαρμογή της DNA τεχνολογίας καθιστά δυνατό τον προσδιορισμό HLA ειδικοτήτων, οι οποίες δεν ανιχνεύονται με εφαρμογή των παραδοσιακών ορολογικών και κυτταρικών τεχνικών.Ανθρωπολογικές μελέτες απεκάλυψαν την ύπαρξη διαφορών στην κατανομή των HLA αλληλομόρφων μεταξύ των διαφόρων πληθυσμών. Η μελέτη της κατανομής των HLA αλληλομόρφων βρίσκει εφαρμογή σε διάφορους τομείς μεταξύ των οποίων η γενετική πληθυσμών, μελέτες συσχέτισης του HLA με την επιδεκτικότητα σε ασθένειες και στις μεταμοσχεύσεις οργάνων. Οι Πομάκοι είναι μια πληθυσμιακή ομάδα ανισόμερα κατανεμημένη στην Ελλάδα και στην Βουλγαρία κοντά στα σύνορα με την Τουρκία . Το μικρότερο τμήμα της κατοικεί στο ορεινό τμήμα των νομών Ξάνθης και Κομοτηνής και το μεγαλύτερο στην αντίστοιχη Βουλγαρική περιοχή της Ροδόπης. Σκοπός της παρούσης μελέτης είναι: α) ο προσδιορισμός των HLA τάξης Ι (HLA-A, -B και -C) και τάξης ΙΙ (HLA -DRB1, - DQB1) αλληλομόρφων γονιδίων στους Πομάκους με εφαρμογή της DNA μεθοδολογίας, β) ο υπολογισμός της συχνότητας των αλληλομόρφων γονιδίων, και η σύγκριση τους με τον Ελληνικό πληθυσμό, το Βουλγαρικό και τον Τουρκικό πληθυσμό και γ) ο υπολογισμός της γενετικής απόστασης μεταξύ των Πομάκων και των 3 άλλων πληθυσμών.ΑΤΟΜΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Μελετήθηκαν συνολικά 126 Πομάκοι υγιείς, μη συγγενείς μεταξύ τους, καθώς και 92 Έλληνες υγιείς μη συγγενείς μεταξύ τους. Το γενωματικό DNA απομονώθηκε από τα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος των ατόμων αυτών με τη χρήση κεκορεσμένου διαλύματος άλατος. Ο προσδιορισμός των HLA τάξης Ι και τάξης ΙΙ αλληλομόρφων πραγματοποιήθηκε με εφαρμογή των ακόλουθων τεχνικών: α) Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης με τη χρήση ειδικής αλληλουχίας εκκινητών (Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Primers, PCR-SSP) και β) ) Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης-Ανάστροφος Υβριδισμός (Polymerase Chain Reaction—reverse dot blot). Ο προσδιορισμός των συχνοτήτων των HLA αλληλομόρφων γονιδίων έγινε με τον τύπο του Brenstein : GF=1-√1-AgF Ενώ η σύγκριση των αλληλόμορφων έγινε με τον υπολογισμό τον χ², η γενετική απόσταση έγινε με βάση την γονιδιακή συχνότητα βάσει του τύπου cavalli-sfortza:D = 4(1- Cosθ)/k-1 όπου Cosθ = ∑√(GfiA)(GfiB) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Στην HLA τάξης-Ι και τάξης ΙΙ περιοχή τα συχνότερα HLA-A, -B, -C, -DRB1 και -DQB1 αλληλόμορφα στους Πομάκους ήταν τα ακόλουθα:HLA-A: Α*0201(41%), Α*0301(13%), Α*0101(12%), Α*2402(12%), και Α*2601(7.4%). HLA-B: Β*1801(21%), Β*5101(9.2%), Β*3501(9%), Β*4402(8.3%), Β*4403(7.4%) και Β* 0801(7.4%). HLA-C: Cw*0701(29%), Cw*0401(19%), Cw*1203(12%), Cw*0602(10%) και Cw*0202(9.6%). HLA-DRB1: DRB1*1104(17.8%), DRB1*0701(11.8%), DRB1*0101(11.3%), DRB1*1501(10.4%) και DRB1*1601(8.7%).HLA-DQB1: DQB1*0301(38.3%), DQB1*02(19.4%) και DQB1* 0501(15%).Αντίστοιχα τα συχνότερα αλληλόμορφα στο Ελληνικό πληθυσμό ήταν τα ακόλουθα: HLA-A: Α*0201(23.2%), Α*2402(17.5%), Α*0301(12.3%) και Α*0101(12.3%). HLA-B: Β*5101(15.2%), Β*1801(14%) και Β*3501(8.9%).HLA-C: Cw*0401(23.2%), Cw*0701(23.3%), Cw*1203(11.7%), Cw*0702(8.4%) και Cw*0202(8.4%).HLA-DRB1: DRB1*1104(18.6%), DRB1*1601(12.1%), DRB1*1101(8.4%), DRB1*(6.7%), DRB1*0101(5.6%) και DRB1*1501(5.6%).HLA-DQB1: DQB1*0301(31.7%), DQB1*0502(16.6%), DQB1*02(13.4%) και DQB1*0501(9.1%). Η τιμές των γενετικών αποστάσεων είναι ως εξής:.α. Υψηλής διακριτικότητας ανάλυση.ΠΛΗΘΥΣΜΙΑΚΗ ΟΜΑΔΑD.HLA-AD.HLA-BD.HLA-CD.HLA-DRB1D.HLA-DQBD.HLA-(A+B)D.HLA-(A+B+DR)ΠΟΜΑΚΟΙ-ΕΛΛΗΝΕΣ0.2070.1140.2300.2010.4500.2920.475ΠΟΜΑΚΟΙ-ΒΟΥΛΓΑΡΟΙ0.2240.123-0.185-0.3200.480.β. Χαμηλής διακριτικότητας ανάλυση. ΠΛΗΘΥΣΜΙΑΚΗ ΟΜΑΔΑD.HLA- AD.HLA-BD.HLA-DRB1D.HLA-(A+B)D.HLA-(A+B+DR)ΠΟΜΑΚΟΙ-TOYRKOI0.3710.200.4100.5020.837Σημειώνεται ότι η τυποποίηση των HLA αλληλόμορων στον Τουρκικό πληθυσμό έγινε με την χρησιμοποίηση χαμηλής διακριτικότητας ανάλυση (143). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Η παρούσα μελέτη επέτρεψε για πρώτη φορά την ακριβή περιγραφή της κατανομής των HLA αλληλομόρφων σε μια κλειστή πληθυσμιακή ομάδα των Πομάκων της Ελλάδας. Με βάση τον υπολογισμό των συχνοτήτων των HLA γονιδίων, την στατιστική σημαντικότητα του P με διόρθωση και την γενετική απόσταση στους HLA-A, -B, -C, -DR και -DQ τόπους προκύπτει ότι η πληθυσμιακές ομάδες, που βρίσκονται γενετικά πλησιέστερα στους Πομάκους είναι οι Βούλγαροι και οι Έλληνες, παρά οι Τούρκοι. Αυτό οφείλεται πιθανά στη Βουλγαρική κυριαρχία που είχαν οι Πομάκοι για πολλά χρόνια, καθώς και στην κλειστή κοινωνία των Πομάκων που έμεινε χωρίς σημαντικές επιμειξίες ακόμα και σήμερα. Κατά συνέπεια οι Πομάκοι κράτησαν τα κοινά χαρακτηριστικά τους με τους Βούλγαρους και με τους Έλληνες που και αυτοί οι δυο πληθυσμοί γενετικά είναι πολύ κοντά μεταξύ τους (G.D=0.317). Το ανοσογενετικό προφίλ των Πομάκων είναι χαρακτηριστικό των Καυκάσιων πληθυσμών, όπως αυτό διαγράφεται με χρήση των HLA δεικτών. Τα αποτελέσματα της παρούσης μελέτης μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε μελέτες συσχέτισης του HLA με την επιδεκτικότητα σε νοσήματα, καθώς και στις μεταμοσχεύσεις οργάνων. Τέλος τα αποτελέσματα της παρούσης μελέτης βρίσκονται σε συμφωνία με τα ιστορικά δεδομένα, τον γεωγραφικό εντοπισμό και τις μετακινήσεις των πληθυσμών διάμεσο των αιώνων.