Ανοσοϊστοχημική μελέτη του αγγειακού πλέγματος του οδοντικού πολφού και τρισδιάστατη αναπαράσταση

Abstract

The aim of this study was the histological investigation of the vascular plexus of human dental pulp by means of immunohistochemistry, immunofluorescence and three-dimensional reconstruction.The study of blood vessels is based on the study of the endothelial cells, which consist of unique and invariant components of the vessel wall. Therefore, CD34 was employed, as it is considered to be a panendothelial marker.Material and methodsThirteen human premolars, fully erupted, free of carries, restorations, clinical and rontgenological findings, extracted for orthodontic reasons, were used in this study.Eight pulp tissues of the above teeth were used after gently removal. Four of them were immunohistochemically proceeded. Paraffin serial cross sections 5μm thick, were stained with CD34 monoclonal antibody according to the StreptComplex technique protocol and examined and digitized under optical and confocal (Bio-Rad MRC 600) microscope. Immunofluorescency (CD34 monoclonal antibody conjugated with Cy5) was applied on the rest four pulps, which were cut in serial paraffin sections 10μm thick. The sections were examined and digitized under confocal microscope (Leica TCS SP2AOBS). Five teeth were decalcified and stained with eosin. The 30μm thick serial sections were examined and digitized under confocal microscope (Bio-Rad MRC 600). Three-dimensional reconstructions of the pulpal vascular plexuses were achieved by the use of EIKONA 3D and ELLIPSE 3D software packages.ResultsBoth histological methods that were used, CD34 immunohistochemical application by ABC technique and immunofluorescence (CD34 conjugated with Cy5), showed strong, homogenous and reproducible staining pattern with the brown color of the vessels’ wall for the first and with the characteristic intense red color of the vessels’ wall for the second. Three-dimensional reconstructions of the dental pulp vascular plexus that were achieved using immunofluorescence sections and fully automatic vessel segmentation provide better results than the ones that were created using immunohistochemistry on decalcified sections and manually vessel segmentation.Conclusions CD34 conjugated with Cy5 combined with confocal microscopy examination and 3D reconstruction is a useful tool for the study of the vascular plexus of the human dental pulp, without pulpal tissue destruction.

Σκοπός της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη του αγγειακού πλέγματος του οδοντικού πολφού με τη βοήθεια της ανοσοϊστοχημείας, του ανοσοφθορισμού, οπτικού μικροσκοπίου, συνεστιακού μικροσκοπίου σάρωσης με ακτίνες λέιζερ και τρισδιάστατης αναπαράστασης.Υλικό και μέθοδοςΔεκατρείς υγιείς προγόμφιοι, πλήρους ανατολής, ελεύθεροι τερηδόνας, αποκαταστάσεων, κλινικών και ακτινογραφικών ευρημάτων, εξαχθέντες για ορθοδοντικούς λόγους, χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη διδακτορική διατριβή.Από τα οχτώ δόντια χρησιμοποιήθηκαν οι οδοντικοί πολφοί, μετά από την αποκόλλησή τους από τα οδοντινικά τοιχώματα.Στους τέσσερεις εφαρμόστηκε με την ανοσοϊστοχημική μέθοδo StreptComplex το αντίσωμα CD34 σε τομές παραφίνης πάχους 5μm. Οι τομές εξετάσθηκαν και ψηφιοποιήθηκαν σε Οπτικό Μικροσκόπιο και σε Συνεστιακό Μικροσκόπιο Σάρωσης με Ακτίνες Λέιζερ (Bio-Rad MRC 600). Στους υπόλοιπους τέσσερεις εφαρμόστηκε με τη μέθοδο του ανοσοθφορισμού το αντίσωμα CD34 συζευγμένο με το φθοριόχρωμα Cy5 σε τομές παραφίνης πάχους 10μm. Οι τομές εξετάσθηκαν και ψηφιοποιήθηκαν σε Συνεστιακό Μικροσκόπιο Σάρωσης με Ακτίνες Λέιζερ (Leica TCS SP2AOBS).Σε πέντε δόντια εφαρμόστηκε απασβεστίωση, έγκλειση σε γλυκολμεθακρυλική ρητίνη και χρώση εωσίνης. Οι τομές πάχους 30 μm εξετάσθηκαν και ψηφιοποιήθηκαν σε Συνεστιακό Μικροσκόπιο Σάρωσης με Ακτίνες Λέιζερ (Bio-Rad MRC 600).Για τις τρισδιάστατες αναπαρστάσεις χρησιμοποιήθηκαν οι ψηφιοποιημένες εικόνες των ανωτέρω τομών με τη χρήση των λογισμικών EIKONA 3D και ELLIPSE 3D.ΑποτελέσματαΚαι οι δύο ιστολογικές μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν, η ανοσοϊστοχημική εφαρμογή του CD34 με τη μέθοδο ABC και η εφαρμογή του CD34 συζευγμένου με το φθοριόχρωμα Cy5 με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού, σε τομές παραφίνης, έδειξαν ισχυρή, ομοιογενή και επαναλαμβανόμενη χρώση με χαρακτηριστικό καφέ χρώμα η πρώτη και χαρακτηριστικό έντονο κόκκινο χρώμα η δεύτερη, σε όλα τα αγγεία του ανθρώπινου υγιούς οδοντικού πολφού, από τα τριχοειδή μέχρι τα αρτηριόλια και τα φλεβιδία.Οι τρισδιάστατες αναπαραστάσεις του οδοντικού πολφικού αγγειακού πλέγματος που επιτεύχθηκαν χρησιμοποιώντας ανοσοφθορισμό και αυτόματη επιλογή των αγγείων παρέχουν καλύτερα αποτελέσματα από αυτές που δημιουργήθηκαν με τη χρησημοποίηση ανοσοϊστοχημικών τομών και χειροκίνητη επιλογή των αγγείων.ΣυμπέρασμαΤο αντίσωμα CD34 συζευγμένου με το φθοριόχρωμα Cy5 ψε συνδυασμό με τη συνεστιακή μικροσκοποία και τη τρισδιάστατη αναπαράσταση αποτελεί ένα χρήσιμο εργαλείο για τη μελέτη του αγγειακού πλέγματος του ανθρώπινου οδοντικού πολφού, χωρίς καταστροφή του περιβάλλοντος πολφικού ιστού.