Τρανσκριπτομική και πρωτεομική ανάλυση του σημαντικότερου παράσιτου της ελιάς, του εντόμου Bactrocera oleae, με έμφαση στα συστήματα φυλοδιαχωρισμού και ανθεκτικότητας στα εντομοκτόνα

Abstract

The olive fruit fly, Bactrocera oleae (Tephritidae), is the most important enemy of cultivated olives, causing around 30% of damages per annum. Control of the fly is mainly based on chemical insecticides. In our country, organophosphate and pyrethroid insecticides are primarily used, however, the naturalyte spinosad has been introduced in recent years. Intensive as well as improper use of insecticides has hazardous effects, such as ecological disturbances, establishment and spread of resistance, dangerous toxicological effects and consequences on human health. More environmentally friendly approaches have also been proposed, such as the sterile insect technique (Sterile Insect Technique, SIT), which involves the mass rearing and releasing of sterilized insects in nature. This method has been successfully used to control other insects (eg. Mediterranean fly) in many regions worldwide, however the SIT has not been successfully applied in the olive fly yet. As has been shown in many cases, the successful application of SIT presupposes good knowledge of the insect’s biology and ecology, as well as the availability of effective molecular and genetic tools. Given the minimal information about olive fly’s genome, this research aimed at the development of proteomic and transcriptomic tools in order to identify and isolate genes that are involved in pathways of sex differentiation or and spinosad resistance.Transcriptomic analysis: In order to identify genetic loci that are involved either in spinosad resistance or that are implicated in sex differentiation, RNA was isolated either from heads of sensitive and resistant to spinosad insects, or from the reproductive systems of male and female flies. RNA was converted into cDNA and subsequently massively sequenced in the SOLiD platform of the Fleming Institute in Athens. The bioinformatic analysis resulted in a number of genes with differential expression in spinosad sensitive and resistant flies, as well as in male and female reproductive systems of B. oleae. Processing and comparison of more than 13,000 genes identified the statistically significant upregulation of nine genes and statistically significant downregulation of ~40 genes between sensitive and resistant to spinosad insects. Similarly, 330 genes were upregulated in the female reproduction system while 1238 were downregulated in male testes flies. Several genes were further selected for validation through qRT-PCR. Twelve reproductive loci were considered: kl2 (male fertility factor, kl2), kl3 (male fertility factor, kl3), kl5 (male fertility factor, kl5), ory (occludin-related Y protein), fem-1 (sex-determining protein fem-1), gas8 (growth arrest specific protein 8), lobo (lost boys), ix (intersex), pbl (pebble) and hcf (host cell factor C1) that were overexpressed in males and the two genes sox and pcp (pupal cuticle protein 78E) that were overexpressed in female flies. The results confirmed significant overexpression in male testes for genes kl2, kl3, kl5, ory, fem-1, gas8, lobo, pbl, hcf and significant overexpression of pcp in female tissues while minimal differences were observed in ix expression between males and females. qRT-PCR did not validate the expression profile of the sox gene obtained from RNA-seq. Furthermore, validation of the genes implicated in spinosad resistance was performed on two resistant and two sensitive populations of B. oleae. The resistant populations were: a laboratory strain (SPIN) selected by continually increasing amounts of the insecticide in its diet; and a wild population from California (w-CAL) which has a 13 times greater resistance compared to the laboratory sensitive strain. The sensitive populations were: the laboratory strain (LΑΒ) which has been reared in laboratory conditions over the past ~40 years; and a population derived from olives of the region of Volos-Agria (w-GR) where insecticides are not used. In total, sixteen loci were studied, many of which belong to energy metabolism groups: Yolk protein 2 (Yp2), ATP synthase FO subunit 6 (ATP synthase), Low affinity cationic amino acid transporter 2 (CAT-2), Serine protease 6 (SP6), 4-nitrophenylphophatase (pNPPase), Salivary Cys-rich secreted peptide-vWF (SalCys), Cytochrome P450 6a23-like (Cyp6α23) and Antigen 5 precursor (Ant5) were upregulated in resistant to spinosad insects; and Heat-shock protein 70 (Hsp70), Heat-shock protein 23 (Hsp23), Larval serum protein 1 (LSP1), HexamerinL1 (HexL1), Chitinase 5 (Cht5), Oxidase/peroxidase (oxidase), Macrophage mannose receptor 1 (mmr1) and Cell division cycle-associated protein 7 (Cdc) were down regulated in resistant flies. The results confirmed a significant overexpression of genes Yp2, ATP synthase, CAT-2, SP6, pNPPase, SalCys and Cyp6α23 in resistant insects and significant overexpression of genes Hsp70, Hsp23, LSP1, HexL1, Cht5 in sensitive flies. For genes Ant5, oxidase, mmr1 and Cdc the RNA seq result was not confirmed.Proteomic analysis: For proteomic analysis, a two-dimensional electrophoresis (2D-PAGE) for heads of male and female insects was initially performed, in order to study the differential expression of proteins in the two sexes of the fruit fly. Subsequently, the differentially expressed proteins were identified, isolated, followed by digestion with trypsin and analyzed by mass spectrometry in the Athens Fleming Institute. Finally, the results were analyzed through bioinformatics analysis and isolated male and female differentially expressed proteins. These proteins belong to different functional groups such as cytoskeleton, metabolism, synaptosomal, signal transduction and oxidative stress. Moreover, a new peptidomic approach was applied. In order to discover the mechanisms involved in sex differentiation systems, at first tissues were collected from the reproductive systems of male and female insects which were then homogenized in the appropriate lysis buffer and the peptides were isolated. MALDI TOF-TOF analysis was subsequently followed and the outcoming results were analyzed with the MASCOT software. This analysis successfully identified peptides overexpressed in either male or female olive fly tissues.

Το έντομο Bactrocera oleae (Tephritidae), κοινώς ο δάκος της ελιάς, είναι ο σημαντικότερος εχθρός της ελιάς και η ζημιά που προκαλεί φτάνει το 30% ετησίως. Οι καταστροφικές του συνέπειες τον καθιστούν στόχο συστηματικού ελέγχου, κυρίως με χρήση χημικών εντομοκτόνων. Για την καταπολέμηση του εντόμου στη χώρα μας χρησιμοποιούνται κυρίως οργανοφωσφορικά εντομοκτόνα, ενώ σε μικρότερη κλίμακα εφαρμόζονται οι συνθετικές πυρεθρίνες και πρόσφατα ο νατουραλίτης spinosad. Η μη ορθολογική χρήση αυτών εμπεριέχει κινδύνους, όπως οικολογικές διαταραχές, δημιουργία και εξάπλωση ανθεκτικότητας, επιβλαβείς τοξικολογικές επιδράσεις και συνέπειες στην υγεία του ανθρώπου. Για τον έλεγχο φυσικών πληθυσμών του εντόμου έχουν προταθεί νέες φιλικότερες προς το περιβάλλον μέθοδοι, όπως η τεχνική του στείρου εντόμου (Sterile Insect Technique, SIT) που προϋποθέτει τη μαζική εκτροφή και εξαπόλυση στείρων εντόμων στη φύση. Η μέθοδος αυτή έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για τον έλεγχο άλλων εντόμων (πχ. Μεσογειακή μύγα) σε διάφορες περιοχές του κόσμου, ωστόσο η SIT δεν έχει εφαρμοσθεί με επιτυχία ακόμη στον δάκο. Όπως έχει δειχθεί σε πολλές περιπτώσεις, η επιτυχής εφαρμογή της SIT προϋποθέτει καλή γνώση της βιολογίας και της οικολογίας του εντόμου, καθώς και αποτελεσματικά μοριακά και γενετικά εργαλεία. Δεδομένου ότι οι πληροφορίες για το γονιδίωμα του δάκου είναι ελάχιστες, η παρούσα έρευνα έχει σκοπό την ανάπτυξη εργαλείων πρωτεομικής και τρανσκριπτομικής που θα βοηθήσουν τις προσπάθειες αποτελεσματικότερης εφαρμογής SIT και τον εντοπισμό και την απομόνωση γονιδίων του δάκου που εμπλέκονται είτε σε μονοπάτια φυλοδιαχωρισμού είτε ανθεκτικότητας στο εντομοκτόνο spinosad. Τρανσκριπτομική ανάλυση: Η ανάλυση του τρανσκριπτώματος του δάκου στόχευε αφενός στην αποκάλυψη γενετικών τόπων που εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα του δάκου στο spinosad και αφετέρου στον εντοπισμό γονιδίων διαχωρισμού των δύο φύλων. Για το σκοπό αυτό, RNA απομονώθηκε είτε από κεφάλια ανθεκτικών και ευαίσθητων στο spinosad εντόμων, είτε από το αναπαραγωγικό σύστημα αρσενικών και θηλυκών ατόμων. Το RNA αυτό μετατράπηκε σε cDNA και ακολούθησε η αλληλούχησή του. Η αλληλούχηση πραγματοποιήθηκε στο Ινστιτούτο Φλέμινγκ με την τεχνολογία SOLiD. Η βιοπληροφορική ανάλυση των δειγμάτων κατέληξε σε πλήθος γονιδίων διαφορετικής έκφρασης σε ευαίσθητα και ανθεκτικά στο spinosad έντομα καθώς επίσης και σε αρσενικά και θηλυκά άτομα B. oleae. Η επεξεργασία και σύγκριση περισσότερων από 13.000 γονιδίων προσδιόρισε τη στατιστικά σημαντική υπερέκφραση 9 γονιδίων και στατιστικά σημαντική υποέκφραση ~40 γονιδίων ανάμεσα σε ευαίσθητα και ανθεκτικά στο spinosad έντομα. Αντίστοιχα, 330 γονίδια είχαν υπερέκφραση στα θηλυκά έντομα ενώ 1238 υπερεκφράζονται στα αρσενικά έντομα. Στη συνέχεια επιλέχθηκαν είτε γονίδια με ιδιαίτερα διαφορετική έκφραση είτε γονίδια ιδιαίτερου ενδιαφέροντος για περαιτέρω λειτουργική ανάλυση μέσω qRT-PCR. Για τη λειτουργική ανάλυση διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε θηλυκά και αρσενικά άτομα μελετήθηκαν οι δώδεκα γενετικοί τόποι: kl2 (male fertility factor, kl2), kl3 (male fertility factor, kl3), kl5 (male fertility factor, kl5), ory (occludin-related Y protein), fem-1 (sex-determining protein fem-1), gas8 (growth arrest specific protein 8), lobo (lost boys),ix (intersex), pbl (pebble) και hcf (host cell factor C1) που υπερεκφράζονται στα αρσενικά και τα δύο γονίδια sox και pcp (pupal cuticle protein 78E) που υπερεκφράζονται στα θηλυκά έντομα. Στα αποτελέσματα που προέκυψαν επιβεβαιώθηκε σημαντική διαφορά αυξημένης έκφρασης στα αρσενικά έντομα για τα γονίδια kl2, kl3, kl5, ory, fem-1, gas8, lobo, pbl, hcf και το γονίδιο pcp με υπερέκφραση στα θηλυκά έντομα ενώ ελάχιστες διαφορές παρατηρήθηκαν μεταξύ των αρσενικών και θηλυκών εντόμων για το γονίδιο ix. Μόνο για το γονίδιο sox δεν διαπιστώθηκε το αναμενόμενο αποτέλεσμα. Παράλληλα, για τη λειτουργική ανάλυση των γονιδίων που εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα, συνολικά μελετήθηκαν δύο ανθεκτικοί και δύο ευαίσθητοι πληθυσμοί B. oleae. Οι ανθεκτικοί πληθυσμοί ήταν ο εργαστηριακός πληθυσμός (SPIN) που είχε επιλεγεί μέσω συνεχούς προσθήκης του εντομοκτόνου στη διατροφή του και ένας φυσικός πληθυσμός από την Καλιφόρνια (w-CAL) που εμφάνιζε 13 φορές αυξημένη ανθεκτικότητα σε σχέση με εργαστηριακό ευαίσθητο στέλεχος. Οι ευαίσθητοι πληθυσμοί ήταν ο εργαστηριακός (LΑΒ) που εκτρέφεται σε εργαστηριακές συνθήκες τα τελευταία ~40 χρόνια και ένας πληθυσμός που προέκυψε από ελαιόκαρπους της περιοχής Βόλου- Αγριάς (w-GR) όπου δεν γίνεται χρήση εντομοκτόνων. Συνολικά μελετήθηκαν οι δεκαέξι γενετικοί τόποι που αρκετοί ανήκουν σε ομάδες μεταβολισμού ενέργειας: Yolk protein 2 (Yp2), ATP synthase FO subunit 6 (ATP synthase), Low affinity cationic amino acid transporter 2 (CAT-2), Serine protease 6 (SP6), 4-nitrophenylphophatase (pNPPase), Salivary Cys-rich secreted peptide-vWF (SalCys), Cytochrome P450 6a23-like (Cyp6α23) και Antigen 5 precursor (Ant5) που υπερεκφράζονται στα ανθεκτικά στο spinosad έντομα και Heat-shock protein 70 (Hsp70), Heat-shock protein 23 (Hsp23), Larval serum protein 1 (LSP1), HexamerinL1 (HexL1), Chitinase 5 (Cht5), Oxidase/peroxidase (oxidase), Macrophage mannose receptor 1 (mmr1) και Cell division cycle-associated protein 7 (Cdc) που υποεκφράζονται στα ανθεκτικά έντομα. Στα αποτελέσματα που προέκυψαν επιβεβαιώθηκε σημαντική διαφορά αυξημένης έκφρασης στα ανθεκτικά έντομα για τα γονίδια Yp2, ATPsynthase, CAT-2, SP6, pNPPase, SalCys και Cyp6α23 αλλά και των γονιδίων Hsp70, Hsp23, LSP1, HexL1, Cht5 με υπερέκφραση στα ευαίσθητα έντομα. Για τα γονίδια Ant5, oxidase, mmr1 και Cdc δεν διαπιστώθηκε το αναμενόμενο αποτέλεσμα. Πρωτεομική ανάλυση: Για την πρωτεομική ανάλυση, αρχικά πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων (2D-PAGE) σε κεφάλια από αρσενικά και θηλυκά έντομα για τη μελέτη της διαφορικής έκφρασης των πρωτεϊνών μεταξύ των δύο φύλων του δάκου. Στη συνέχεια, οι διαφορετικές πρωτεΐνες εντοπίστηκαν, αποκόπηκαν, ακολούθησε πέψη με τρυψίνη και ανάλυση με φασματομετρία μάζας στο ινστιτούτο Αλέξανδρος Φλέμινγκ. Τέλος, τα αποτελέσματα επεξεργάστηκαν μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης, όπου προέκυψαν πρωτεΐνες που εκφράζονται με διαφορετικό τρόπο ανάμεσα σε θηλυκά και αρσενικά έντομα. Οι πρωτεΐνες αυτές ανήκουν σε διαφορετικές λειτουργικές ομάδες όπως κυτοσκελετού, μεταβολισμού, συναπτοσωμικές, μεταγωγής σήματος και οξειδωτικού στρες. Επίσης, έγινε εφαρμογή μιας νέας προσέγγισης μέσω μελέτης των πεπτιδίων. Με σκοπό τη διερεύνηση μηχανισμών που εμπλέκονται σε συστήματα φυλοδιαχωρισμού, αρχικά συλλέχθηκαν όργανα αναπαραγωγής αρσενικών και θηλυκών εντόμων από το εργαστηριακό στέλεχος του δάκου. Στη συνέχεια, έγινε ομογενοποίηση των ιστών με κατάλληλο διάλυμα λύσης και απομόνωση των πεπτιδίων. Ακολούθησε η φασματομετρία μάζας με χρήση MALDI TOF-TOF, λήψη των αποτελεσμάτων των πεπτιδίων με τη χρήση του MASCOT και επεξεργασία των αποτελεσμάτων μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης. Με επιτυχία έγινε εντοπισμός πεπτιδίων που εμπλέκονται σε συστήματα διαχωρισμού των δύο φύλων καθώς παρατηρήθηκε υπερέκφραση τους σε αρσενικά και θηλυκά έντομα αντίστοιχα.