Μοριακός χαρακτηρισμός, μελέτη των εξελικτικών σχέσεων και ανίχνευση ιών της οικογένειας Closteroviridae που σχετίζονται με την ασθένεια μικροκαρπίας της κερασιάς

Abstract

The objective of this work was to study the presence of Little cherry disease (LChD) in Greece and to characterize the viruses associated with it. For that purpose, field surveys were conducted in stone fruit orchards and samples were tested for the presence of Little cherry virus 1 and -2 (LChV-1 and -2). As long as available in the literature LChV-1 specific RT-PCR assays exhibited limited diagnostic sensitivity, a new nested RT-PCR was developed and used for screening the collected plant material. LChV-2 was not detected in any of the sweet and sour cherries samples tested. On the other hand, LChV-1 was prevalent in sweet cherry, whereas it was also detected for the first time in Greece in sour-cherry, plum and peach trees. The genetic diversification of this virus and the evolutionary mechanisms shaping its population structure were also studied. For that purpose, several LChV-1 isolates from diverse hosts and regions of Greece were collected and used in the present study. Part of their obtained RdRp, HSP70h and CP genes were used, along with homologous sequences from foreign isolates, for phylogenetic, positive selection and recombination analyses. The phylogenetic analysis grouped the isolates in four distinct groups irrespective of their host or geographical origin. The positive selection analysis has shown that although the intraspecies diversity was high, the three genomic regions studied (RdRp, HSP70h, CP) are under strong negative selection. Moreover, a natural homologous recombination event was observed in a Greek isolate with the recombination break-point mapping to the 3΄terminus of the RdRp gene. One isolate (G15 3) found to be the most divergent in the three genomic regions studied, was selected to be further characterized with the next generation sequencing platform (NGS). Comparative analysis of its sequence unveiled an overall nucleotide divergence of 26-27% from all fully sequenced LChV-1 isolates whereas insertion-deletion (indel) polymorphisms were observed at a significant number of positions in its genome. Furthermore, a large part of the genome (10.794 nt) of an apparently distinct LChV-1 isolate (GR) from sweet cherry was also sequenced and was found to be almost identical with a published isolate. In G15 3 and GR isolates, indel polymorphisms and a point mutation observed at the same positions within the genomic ORFs coding for the p4, HSP70h and CPm seem to result in their premature termination thus putatively affecting the size of these proteins. For the detection and quantification of LChV-1 a real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (Real Time RT-qPCR) was developed. Therefore, specific primers and a TaqMan probe were designed, using conserved regions of the capsid protein gene (CP) and their detection range was evaluated using several divergent viral isolates. The amplification efficiency of the developed method was estimated at 96,7%, whereas the quantification limit ranged from 100 to 108 transcript RNA copies. The RT-qPCR was applied for the study of the virus fluctuation within leaves and phloem tissues throughout the growing season and the most appropriate periods and plant tissues were determined for sampling.

Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση της παρουσίας της ασθένειας της μικροκαρπίας της κερασιάς (LChD) στην Ελλάδα και ο χαρακτηρισμός των ιών που σχετίζονται με αυτήν. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε επισκόπηση οπωρώνων κερασιάς και άλλων ειδών πυρηνοκάρπων για την παρουσία των Little cherry virus 1 και -2 (LChV-1 και -2). Στην περίπτωση του LChV-1, οι διαθέσιμες στη βιβλιογραφία δοκιμές RT-PCR παρουσίασαν περιορισμένη ευαισθησία ανίχνευσης και για το λόγο αυτό αναπτύχθηκε μία νέα εστιασμένη RT-PCR δοκιμή η οποία και χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του ιού στο φυτικό υλικό που συλλέχθηκε. Κατά τον έλεγχο δεν διαπιστώθηκε η παρουσία του LChV-2 σε κερασιά και βυσσινιά. Αντίθετα, ο LChV-1 είναι αρκετά διαδεδομένος στην κερασιά, ενώ ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα σε βυσσινιά, δαμασκηνιά και ροδακινιά. Επιπλέον, μελετήθηκε η γενετική διαφοροποίηση του LChV-1 και προσδιορίστηκαν οι εξελικτικοί μηχανισμοί που διαμορφώνουν τη δομή του πληθυσμού του. Για το σκοπό αυτό συλλέχτηκαν απομονώσεις από διάφορους ξενιστές και περιοχές της Ελλάδος και προσδιορίστηκαν οι αλληλουχίες τμημάτων των γονιδίων RdRp, HSP70h και CP. Οι φυλογενετικές αναλύσεις των περιοχών αυτών κατέταξαν τις Ελληνικές και τις κατατεθειμένες απομονώσεις σε τέσσερις διακριτούς κλάδους ανεξάρτητα από τον ξενιστή ή τη γεωγραφική τους προέλευση. Περαιτέρω ανάλυση θετικής επιλογής με τον υπολογισμό της αναλογίας των μη-συνώνυμων αντικαταστάσεων ανά μη-συνώνυμη θέση (dN) προς τις συνώνυμες αντικαταστάσεις ανά συνώνυμη θέση (dS) έδειξε ότι οι τρεις γονιδιακές περιοχές που μελετήθηκαν υπόκεινται σε ισχυρή πίεση αρνητικής επιλογής. Επιπλέον, προσδιορίστηκε ένα σημείο ανασυνδυασμού στο 3΄ άκρο της RdRp μίας Ελληνικής απομόνωσης (Νο2 ISTO). Μία εκ των απομονώσεων του LChV-1 (G15 3) ήταν γενετικά απομακρυσμένη και στα τρία γονίδια που μελετήθηκαν και επιλέχθηκε να χαρακτηριστεί μοριακά με την πλατφόρμα αλληλούχησης νέας γενιάς (Next Generation Sequencing, NGS). Η συγκριτική ανάλυση της αλληλουχίας της έδειξε ότι η νέα απομόνωση είναι αρκετά διαφοροποιημένη από τις ήδη γνωστές με την παραλλακτικότητα σε νουκλεοτίδια στο σύνολο του γονιδιώματος της να κυμαίνεται από 26-27%, ενώ παρατηρήθηκαν σε σημαντικό αριθμό θέσεων πολυμορφισμοί τύπου προσθήκης ή/και απαλοιφής. Επιπλέον, προσδιορίστηκε τμήμα μήκους 10.794 νουκλεοτιδίων της αλληλουχίας μίας ακόμη διαφοροποιημένης Ελληνικής απομόνωσης (GR), η οποία παρουσίασε υψηλή εξελικτική συγγένεια με μία δημοσιευμένη απομόνωση. Στις απομονώσεις G15 3 και GR παρατηρήθηκε πολυμορφισμός στις ίδιες ακριβώς θέσεις μέσα στα ΑΠΑ που ενδέχεται να επηρεάζουν το μέγεθος των κωδικοποιούμενων πρωτεϊνών p4, HSP70h και CPm με πρόωρο τερματισμό της έκφρασής τους. Επιπλέον, αναπτύχθηκε μία δοκιμή πραγματικού χρόνου αντίστροφης μεταγραφής-αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (Real Time RT-qPCR) για την αξιόπιστη ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό του LChV-1. Για το σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν εξειδικευμένοι εκκινητές και ιχνηλάτης Taqman από συντηρημένες περιοχές του γονιδίου της καψιδιακής πρωτεΐνης (CP) και το εύρος ανίχνευσής τους αξιολογήθηκε με τη χρήση γενετικά διαφοροποιημένων απομονώσεων του ιού. Η απόδοση της αντίδρασης που αναπτύχθηκε ήταν 96,7%, ενώ το δυναμικό εύρος του ποσοτικού προσδιορισμού της ήταν 100-108 αντίγραφα RNA. Η μέθοδος αυτή εφαρμόστηκε για τη μελέτη της διακύμανσης της συγκέντρωσης του ιού στη διάρκεια του έτους σε βλαστό και φύλλα και προσδιορίστηκαν οι καταλληλότερες περίοδοι και φυτικοί ιστοί για δειγματοληψία.