Σύνθεση και μελέτη νέων αναστολέων ενδοκυτταρικών φωσφολιπασών Α2 με πιθανή αντιφλεγμονώδη και αντικαρκινική δράση

Abstract

Phospholipases A2 are enzymes that hydrolyze the sn-2 ester bond of the cellular membrane’s phospholipids. This hydrolysis has as a result the release of free fatty acids and lysophospholipids, precursors of eicosanoids and other bioactive molecules. Τhe inflammation caused by these molecules is associated to illnesses such as cancer, autoimmune diseases and cardiac disorders. The superfamily of phospholipases consists of five main groups: the secreted PLA2, the cytosolic, the Ca2+-independent, PAF-acetylhydrolases and the lysosomal PLA2. GIVA cPLA2 and GVIA iPLA2 are the most studied enzymes of this family and have been associated with the development and progression of multiple diseases. iPLA2 has a great part in many physiological cellular functions as are the growth, the proliferation and the apoptosis but mostly is characterized by its ability to maintain the homeostasis of the phospholipid membrane. It has been associated with the pathophysiology of various diseases such as schizophrenia, diabetes, genesis and progression of cancer. All these data suggest that the development of inhibitors of these enzymes and mostly of iPLA2 is an important research target for both further investigation of the structure and function of the enzyme and the creation of new medicines. Studying of the activity of known inhibitors in the literature and their structure-activity relationship led to the design and synthesis of 2-oxoamide derivatives and polyfluoroketone compounds as possible inhibitors of the Ca2+-independent phospholipase A2. In the present work the following were synthesized: 1) 2-Oxoamide derivatives that contain a para-methoxy substituted aromatic core in a distance of four carbon atoms from the activated carbonyl followed by an amino component which differentiates in each derivative. 2) Polyfluoroketone compounds that contain a heterocyclic aromatic ring, a chain of four carbon atoms and the activated carbonyl of the polyfluorogroup. The enzymatic assays of the inhibitors prepared against phospholipases GIVA cPLA2, GVIA iPLA2 and GV sPLA2 were performed in in vitro experiments using the method of mixed micelles. The results showed that 2-oxoamides which presented very good inhibition and good selectivity are those that contained dipeptide norleukine – glycine and a tert-butylester or a benzylester and the one which contained dipeptide leukine – glycine and a tert-butylester which the greatest inhibition showed the 2-oxoamide that contained dipeptide glycine – γ-aminobutyric acid with the tert-butylester by 99.9% and ΧΙ (50)= 0.007. Generally, polyfluoroketones showed low to medium inhibition towards iPLA2. Pentafluoroethyl-ketone containing a methyl-protected indole and a four-carbon chain presented the highest inhibition of 93%.

Οι φωσφολιπάσες Α2 είναι ένζυμα που υδρολύουν τον εστερικό sn-2 δεσμό των φωσφολιπιδίων της κυτταρικής μεμβράνης. Αποτέλεσμα της υδρόλυσης αυτής είναι η απελευθέρωση ελεύθερων λιπαρών οξέων και λυσοφωσφολιπιδίων, προϊόντα που αποτελούν πρόδρομες ενώσεις εικοσανοειδών και άλλων βιοδραστικών μορίων. Η φλεγμονή που δημιουργείται από αυτές τις ενώσεις συνδέεται με ασθένειες όπως ο καρκίνος, τα αυτοάνοσα νοσήματα και οι καρδιακές διαταραχές. Η υπεροικογένεια των φωσφολιπασών αποτελείται από πέντε κύριες ομάδες: τις εκκρινόμενες PLA2, τις κυτοσολικές, τις ανεξάρτητες ιόντων ασβεστίου, τις ακετυλοϋδρολάσες του PAF και τη λυσοσωμική PLA2. Η GIVA cPLA2 και η GVIA iPLA2 είναι τα περισσότερο μελετημένα ένζυμα της οικογένειας αυτής και έχουν συνδεθεί με την ανάπτυξη και εξέλιξη πληθώρας ασθενειών. Η iPLA2 παίζει σημαντικό ρόλο σε πολλές φυσιολογικές κυτταρικές λειτουργίες όπως η ανάπτυξη, ο πολλαπλασιασμός και η απόπτωση αλλά χαρακτηρίζεται κυρίως από την ιδιότητα να διατηρεί την ομοιόσταση της φωσφολιπιδικής μεμβράνης. Έχει συσχετιστεί με τη παθοφυσιολογία διαφόρων νοσημάτων όπως η σχιζοφρένεια, ο διαβήτης, η γένεση και η εξέλιξη του καρκίνου. Όλα αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ανάπτυξη αναστολέων έναντι των ενζύμων αυτών και ιδίως της iPLA2 αποτελεί σημαντικό ερευνητικό στόχο τόσο για την περαιτέρω διερεύνηση της δομής και της λειτουργίας του ενζύμου όσο και για την δημιουργία νέων φαρμακευτικών προϊόντων. Η μελέτη της δραστικότητας των γνωστών αναστολέων της βιβλιογραφίας και η σχέση δομής-δράσης τους οδήγησε στο σχεδιασμό και τη σύνθεση 2-οξοαμιδικών παραγώγων και πολυφθοροκετονικών ενώσεων ως πιθανούς αναστολείς της ανεξάρτητης ιόντων ασβεστίου φωσφολιπάσης Α2. Στην παρούσα εργασία συντέθηκαν: 1) 2-Οξοαμιδικά παράγωγα που περιλαμβάνουν έναν παρα-μεθόξυ υποκατεστημένο αρωματικό πυρήνα σε απόσταση τεσσάρων ανθρακοατόμων από το ενεργοποιημένο καρβονύλιο ακολουθούμενο από ένα άμινο συστατικό το οποίο διαφοροποιείται σε κάθε παράγωγο. 2) Πολυφθοροκετονικές ενώσεις που περιλαμβάνουν έναν ετεροκυκλικό αρωματικό δακτύλιο, μια αλυσίδα τεσσάρων ανθρακοατόμων και το ενεργοποιημένο καρβονύλιο της πολυφθορομάδας. Η ενζυμική αποτίμηση των αναστολέων που παρασκευάστηκαν έναντι των φωσφολιπασών GIVA cPLA2, GVIA iPLA2 και GV sPLA2 πραγματοποιήθηκε σε in vitro πειράματα χρησιμοποιώντας την μέθοδο μικτών μικκυλίων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι πολύ καλή αναστολή και καλή εκλεκτικότητα ως προς την iPLA2 έδειξαν τα 2-οξοαμιδικά παράγωγα που περιείχαν το διπεπτίδιο νορλευκίνη – γλυκίνη και tert-βουτυλεστέρα ή βενζυλεστέρα και αυτό που περιείχε το διπεπτίδιο λευκίνης – γλυκίνης και tert-βουτυλεστέρα ενώ τη μέγιστη αναστολή την παρουσίασε το 2-οξοαμίδιο που περιείχε το διπεπτίδιο γλυκίνης – γ-αμινοβουτυρικού οξέος με τον tert-βουτυλεστέρα με 99.9% αναστολή και ΧΙ (50)= 0.007. Οι πολυφθοροκετονικές ενώσεις γενικά έδειξαν χαμηλή έως μέτρια αναστολή με την ισχυρότερη αναστολή ως προς την iPLA2 να την παρουσιάζει η πενταφθοροαιθυλο-κετόνη που περιείχε το μεθυλο-προστατευμένο ινδόλιο και μια αλυσίδα τεσσάρων ανθρακοατόμων με 93%.