Μελέτη του παθογενετικού ρόλου της κυτταροκίνης RANKL σε διαγονιδιακά ζωικά πρότυπα

Abstract

Receptor activator of NF-κBligand (RANKL) plays a key role in osteoclast-induced bone resorption across a range of degenerative bone diseases, and its specific inhibition has been recently approved as a treatment for women with postmenopausal osteoporosis at high or increased risk of fracture. In the present study, we generated transgenic mice (TghuRANKL) carrying the human RANKL (huRANKL) genomic region and achieved a physiologically relevant pattern of RANKLoverexpression in order to establish novel genetic models for assessing skeletal pathologies associated with excessive RANKL and for testing clinical therapeutic candidates that inhibit human RANKL. TghuRANKL mice of both sexes developed early onset bone loss, and the levels of huRANKL expression were correlated with bone resorption and disease severity. Low copy Tg5516 mice expressing huRANKL at low levels displayed a mild osteoporotic phenotype as shown by trabecular bone loss. Notably, overexpression of huRANKL, in the medium copy Tg5519 line, resulted in severe early-onset osteoporosis characterized by lack of trabecular bone, ditsruction of the growth plate, increased osteocalstogenesis, bone marrow adiposity, increased bone remodeling and severe cortical bone porosity accompanied by decreased bone strength. An even more severe skeletal phenotype developed in the high copy Tg5520 founder with extensive soft tissue calcification. Notably, the osteopetroticphenotype of mutant mice expressing an inactiveform of the endogenous RANKL proteinwasrescueduponcrossingthese mice with TghuRANKL mice, showingthat the transgenic human RANKL proteinisfullyactive in the mouse. Alendronate at the dose of 1mg/Kg was administrered subcutaneously in the low-copy Tg5516 mice once a week. Our results confirmed that alendronate fully restored the osteoporotic trabecular stucture in Tg5516 mice that exhibits a mild phenotype.These novel huRANKL transgenic models of osteoporosis represent an important advance for understanding the pathogenesis and treatment of high- turnover bone diseases and other disease states caused by excessive RANKL.

Η πρωτεΐνη RANKL (ReceptorActivatorofNuclearFactor κBLigand) μέλος της υπεροικογένειας του TNF (TumorNecrosisFactor), αποτελεί το μόριο κλειδί στην διαδικασία της οστικής απορρόφησης καθώς επάγει την διαφοροποίηση, επιβίωση και ενεργότητα των οστεοκλαστών. Η αυξημένη παραγωγή RANKL έχει συνδεθεί με αυξημένη οστική απώλεια σε ασθένειες όπως είναι η οστεοπόρωση, η ρευματοειδής αρθρίτιδα, το πολλαπλούνμυέλωμα, οι οστικές μεταστάσεις και οι περιοδοντικές ασθένειες. Οι μέχρι τώρα κλινικές δοκιμές δείχνουν ότι το Denosumab, ένα αντι-huRANKLμονοκλωνικό αντίσωμα, αναστέλλει αποτελεσματικά την οστική απώλεια και τα κατάγματα σε οστεοπορωτικούς ασθενείς. Ωστόσο, με τα μέχρι στιγμής δεδομένα, δεν υπάρχει ένα ζωικό πρότυπο υπερέκφρασης του RANKL του ανθρώπου (huRANKL) για την άμεση δοκιμή νέων αναστολέων του σε προκλινικό επίπεδο.Χρησιμοποιώντας τεχνολογίες αιχμής, στο εργαστήριο της Καθ. Ε. Ντούνη (Ε.ΚΕ.Β.Ε. «Αλέξανδρος Φλέμιγκ» σε συνεργασία με το Εργαστήριο Γενετικής του Τμήματος Βιοτεχνολογίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών), δημιουργήθηκαν πρόσφατα διαγονιδιακά ποντίκια που φέρουν το RANKL γονίδιο του ανθρώπου (TghuRANKL) ώστε να αναπαραχθούν και να μελετηθούν οι παθολογίες που επάγονται από την υπερέκφραση του RANKL. Για να επιτευχθεί ένα σωστό πρότυπο έκφρασης του huRANKL στο ποντίκι, ως διαγονίδιο χρησιμοποιήθηκε ένα γενωμικό τμήμα μεγέθους 200kb που περιείχε ολόκληρο το RANKL γονίδιο του ανθρώπου. Στα πλαίσια της παρούσας μελέτης αναλύθηκαν τα νέα γενετικά μοντέλα οστεοπόρωσης που προέκυψαν από την υπερέκφραση του RANKL. Τα TghuRANKLδιαγονιδιακά ποντίκια εμφάνισαν, ανεξαρτήτου φύλου πρώιμη εγκατεστημένη οστική απώλεια ενώ τα επίπεδα έκφρασης του huRANKLδιαγονιδίου συσχετίστηκαν με την σοβαρότητα του φαινοτύπου. Η διαγονιδιακή σειρά Tg5516 με χαμηλή έκφραση του huRANKLδιαγονιδίου εμφάνισε ήπιο οστεοπορωτικό φαινότυπο με οστική απώλεια στο σπογγώδες οστούν και μειωμένη οστική αντοχή. Στη διαγονιδιακή σειρά Tg5519 με υψηλή έκφραση του huRANKLδιαγονιδίου, παρατηρήθηκε σοβαρή οστική απώλεια στο σπογγώδες, προοδευτική καταστροφή της αυξητικής πλάκας, αυξημένη οστεοκλαστογένεση, αυξημένη οστική ανακατασκευή και έντονα πορώδης δομή στη φλοιώδη μοίρα του οστού,συνοδευόμενη από μειωμένη οστική αντοχή. Ο πιο σοβαρός οστεοπορωτικός φαινότυπος εμφανίστηκε στην διαγονιδιακή σειρά Tg5520 που είχε την υψηλότερη έκφραση του huRANKLδιαγονιδίου και χαρακτηρίζεται από σοβαρή οστική απώλεια στο σπογγώδες, πορώδη δομή στο φλοιώδες οστούν, εκτεταμένη ασβεστοποίηση μαλακών ιστών και κατάγματα. Τα ΤghuRANKL όταν διασταυρώθηκαν με τα οστεοπετρωτικά ποντίκια που φέρουν στο γονιδίωμα τους μια σημειακή μετάλλαξη με αποτέλεσμα την απώλεια λειτουργίας του RANKL, ανέστειλαν τον οστεοπετρωτικό φαινότυπο. Τέλος, η χορήγηση αλενδρονάτης στην σειρά Tg5516 με τον ήπιο οστεοπορωτικό φαινότυπο ανέστειλε πλήρως την οστική απώλεια .Τα TghuRANKLδιαγονιδιακά ποντίκια αποτελούν ένα μοναδικό γενετικό πρότυπο οστικής απώλειας και ιδανικό εργαλείο για την μελέτη των μηχανισμών που εμπλέκονται στην οστική απορρόφηση καθώς και για την αξιολόγηση νέων φαρμακευτικών ουσιών και πιθανών αναστολέων της δράσης του RANKL σε προκλινικό επίπεδο, στοχεύοντας ασθένειες με οστική απώλεια όπως είναι η οστεοπόρωση.