Λειτουργική ανάλυση των φωσφατασών διπλής εξειδίκευσης (DUSPs) στη drosophila melanogaster

Abstract

MAPK (Mitogen Activated Protein Kinases) signaling pathways have been extensively studied and are known to control multiple biological processes, such as proliferation, apoptosis, differentiation and cellular homeostasis. Based on the amino acid residue present in the conserved activation motif TxY, MAPKs are divided in three families, the Extracellular Signal Regulated Kinases (ERKs), the c-Jun N-terminal Kinases (JNKs) and the p38 kinases. MAPKs are activated by a variety of stimuli to induce distinct cellular responses. Environmental stressors have been shown to preferentially induce the activation of JNK and p38 kinases, which together form the MAPK-subgroup of Stress Activated Protein Kinases (SAPKs). The intensity and duration of MAPK activation, amongst other factors, are known to modulate the final outcome of the signaling. Dual Specificity Phosphatases (DUSPs) have emerged as key regulators of MAPK-activity in development, cancer and environmental stress conditions and are promising therapeutic targets for cancer treatment. DUSPs belong to the super-family of Protein Tyrosine Phosphatases and are cysteinebased enzymes able to remove phosphate groups from both phospho-tyrosine and phospho-threonine residues. In mammals several members of the DUSP-family have been shown to specifically target and inactivate MAPKs. Analysis of the Drosophila genome, in combination with extensive genetic studies, have provided proof for the main components of the MAPK signaling pathways being highly conserved between mammals and Drosophila, thus establishing the fly as a model organism for their study. DUSPs, as other MAPK-regulators, are evolutionarily conserved in Drosophila melanogaster. In particular, six DUSPs have been annotated in the Drosophila genome of which Puckered is the most studied. Puckered was first identified as a JNKspecific phosphatase involved in the repression of JNK signaling at the final steps of dorsal closure, a late morphogenetic event of Drosophila embryogenesis. Later studies also implicated Puckered in other developmental processes. In adult flies Puckered has been shown to affect innate immunity, wound healing, stress tolerance and longevity. The aim of this study was the functional analysis of DUSPs in Drosophila melanogaster. With respect to that, our efforts focused on two main objectives. First, we were interested in elucidating the post-translational regulatory mechanisms of Puckered activity, under oxidative stress conditions, and second we aimed to address the in vivo role of Puckered in the development and function of the Drosophila nervous system. In silico analysis of the Puckered amino acid sequence revealed several potential sites bearing the consensus phosphorylation motif for MAPKs, mapping mainly to the Cterminus of the protein. To experimentally evaluate these predictions, endogenous MAPK activation was induced by stimulating HEK293 cells, transiently expressing Puckered, with arsenite. Arsenite is a potent activator of the JNK and p38 pathways in HEK293 cells, only inducing a moderate activation of ERK1/2. Arsenite treatment of Puckered expressing HEK293 cells resulted in a dose dependent up-shift of Puckered mobility in SDS-PAGE. The observed shift of Puckered mobility was due to phosphorylation, since lambdaphosphatase treatment of immunoprecipitated Puckered from extracts of cells coexpressing Puckered with active JNK resulted in its abolition. Co-expression of Puckered with the constitutively active forms of JNK and p38 in HEK293 cells induced Puckered phosphorylation, while ERK activation, upon stimulation of the cells with EGF, had no impact on Puckered. In addition, simultaneous inhibition of both JNK and p38, employing the chemical inhibitors SP600125 and SB203580, resulted in an almost complete loss of the arsenite-induced Puckered phosphorylation. In contrast, the MEK1 inhibitor PD98059, while effectively preventing ERK activation, had no effect on Puckered phosphorylation. From theses results we concluded that Puckered is phosphorylated by JNK and p38 in response to arsenite induced oxidative stress. Analysis of Puckered immuno-precipitates by mass spectrometry identified the presence of phosphate on serine 413. While phosphorylation of serine 413 was identified in Puckered from un-stimulated and arsenite stimulated cells, it was not possible to quantify the relative abundance in each case. The mobility shift of Puckered upon arsenite treatment could therefore be due to phosphorylation at additional sites that escaped detection. In order to determine the effects of phosphorylation on Puckered function we examined both the interaction of Puckered with the SAPKs and the ability of Puckered to attenuate arsenite-induced JNK activation. The interaction of Puckered with the p38 kinase was detected both in the presence and absence of oxidative stress conditions, although in oxidative stress conditions the interaction was enhanced. In contrast, Puckered interaction with JNK was detected only under oxidative stress conditions. Therefore, Puckered interacts with both SAPKs and the interactions are enhanced by the induction of oxidative stress. Finally, the time-course stimulation of Puckered expressing HEK293 cells with arsenite showed that Puckered phosphorylation occurs gradually, reaching its highest level at 60 minutes of treatment. Quantification of active JNK levels, in the presence or absence of Puckered, from extracts of cells subjected to the same time course stimulation showed that the presence of Puckered induced a significant reduction in JNK phosphorylation, evident up to 60 minutes of treatment and inversely correlated with the level of Puckered phosphorylation. This correlation suggests a role for phosphorylation in reducing Puckered activity. The second aim of this study was the evaluation of the in vivo role of Puckered in the development of the nervous system of Drosophila melanogaster. To facilitate this analysis we generated a series of transgenic fly-lines, which would allow the spatiotemporal control of puckered gene silencing in Drosophila. In addition, we developed an antibody against the C-terminal portion of Puckered protein, in order to detect the endogenous molecule in Drosophila tissues. Silencing of puckered in all post-mitotic neurons of the fly, both during embryonic development as well as in the stages of first and second instar larva, resulted in 100% lethality of the organism. Characterization of this embryonic lethal phenotype revealed abnormalities in the formation of the axonal scaffold and the peripheral nerves. The restricted silencing of puckered in the cells of the ventral midline gave similar results, while the genetic dissection of this cell-group showed that puckered function is necessary in the midline neurons but not in the midline glia cells. These results were further supported by the analysis of puckered expression pattern in the embryonic central nervous system, since puckered expression was not detected in glial cells. Analysis of puckered reporter lines revealed that puckered is present in distinct neuronal populations of both the ventral nerve cord and the peripheral nervous system. In particular puckered expression was detected in the aCC/RP2 and the U motor neurons, as well as the pCC and some of the EL inter-neurons. Moreover, results from immunostaining experiments with a Puckered antibody that we developed, revealed conspicuous expression in the embryonic central nervous system and highlighted the longitudinal and commissural axonal tracts, implying a potential function for Puckered in axons. It should be noted that the puckered pattern of expression in the ventral nerve cord was found to be dynamic, increasing its complexity in late embryonic stages. Finally, we characterized the expression pattern of puckered in the adult central nervous system, where puckered was detected both in neuronal and glial cells. Disruption of neuro-transmission within the puckered neuronal circuit resulted in paralysis of the fly.

Τα σηµατοδοτικά µονοπάτια των ενεργοποιούµενων από µιτογόνα ερεθίσµατα πρωτεΐνικών κινασών [ Mitogen Activated Protein Kinases, (MAPKs)] είναι εκτενώς µελετηµένα και ρυθµίζουν πληθώρα βιολογικών διαδικασιών, όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασµός, η απόπτωση, η διαφοροποίηση και η ωσµορύθµιση. Μέχρι στιγµής, έχουν χαρακτηριστεί τρεις υποοικογένειες των MAPKs, αυτή των ελεγχόµενων από εξωκυττάρια ερεθίσµατα κινασών [ Extracellular signal Regulated Kinases, (ERK)], η υποοικογένεια των πρωτεϊνικών κινασών του αµινοτελικού άκρου του µεταγραφικού παράγοντα c -Jun [c-Jun N-terminal Kinases, (JNK)] και τέλος η υποοικογένεια των p38 κινασών. Οι κινάσες JNK και p38, συνιστούν τις ενεργοποιούµενες από στρες πρωτεϊνικές κινάσες [Stress Activated Protein Kinases, (SAPKs)] καθώς η ενεργοποίηση τους επάγεται κατά ειδικό τρόπο σε συνθήκες παρειβαλλοντικού στρες. Η ένταση και η διάρκεια της ενεργοποίησης των MAPKs έχουν δειχθεί να επηρεάζουν την τελική απόκριση του κυττάρου σε δεδοµένο ερέθισµα. Οι φωσφατάσες διπλής εξειδίκευσης [Dual Specificity Phosphatases, (DUSPs)] αποτελούν κύριους ρυθµιστές της ενεργότητας των MAPΚs κατά την διάρκεια της ανάπτυξης, της καρκινικής εξαλλαγής, καθώς επίσης και υπό συνθήκες περιβαλλοντικού στρες. Οι DUSPs ανήκουν στην υπέρ-οικογένεια των πρωτεϊνικών φωσφατασών τυροσίνης [Protein Tyrosine Phosphatases (PTPs)]. Η ενζυµική τους ενεργότητα βασίζεται στην κυστεΐνη του ενεργού τους κέντρου, ενώ δύνανται να αποφωσφορυλιώσουν τόσο κατάλοιπα φώσφο-τυροσίνης όσο κατάλοιπα φώσφο-θρεονίνης. Στα θηλαστικά, αρκετά µέλη της οικογένειας των DUSPs εµφανίζουν εξειδίκευση έναντι των MAPKs. Η ανάλυση του γονιδιώµατος της Drosophila σε συνδυασµό µε γενετικές µελέτες έδειξε ότι τα βασικά χαρακτηριστικά της σηµατοδότησης µέσω MAPKs είναι συντηρηµένα µεταξύ της Drosophila και των θηλαστικών, καθιστώντας τη Drosophila κατάλληλο οργανισµό – πρότυπο για την µελέτη τους. Αντίστοιχα, έξι DUSPs έχουν εντοπιστεί στο γονιδίωµα της Drosophila, εκ των οποίων η φωσφατάση Puckered είναι το πιο καλά χαρακτηρισµένο µέλος τους. Η Puckered αρχικά ταυτοποιήθηκε ως η JNK-ειδική φωσφατάση υπεύθυνη για την καταστολή της σηµατοδότησης µέσω JNK, κατά τα αρχικά στάδια του «ραχιαίου κλεισίµατος» (dorsal closure), ενός µορφογενετικού γεγονότος της εµβρυϊκής ζωής της Drosοphila melanogaster. Μετέπειτα µελέτες επιβεβαίωσαν την συµµετοχή της φωσφατάσης Puckered και σε άλλες αναπτυξιακές διαδικασίες. Στην ενήλικη Drosophila, η δράση της φωσφατάσης Puckered έχει δειχτεί να επηρεάζει την ανοσολογική απόκριση, την επούλωση τραυµάτων, την ανοχή του στρες καθώς επίσης την επιµήκυνση της βιωσιµότητας του οργανισµού. Ο στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η λειτουργική ανάλυση των DUSPs στη Drosophila melanogaster. Συγκεκριµένα, το ενδιαφέρον µας εστιάστηκε στην φωσφατάση Puckered και στην ανάλυση των µηχανισµών µετα-µεταφραστικής ρύθµισης της δράσης της. Παράλληλα επιχειρήσαµε να διαλευκάνουµε τον λειτουργικό ρόλο της Puckered in vivo, κατά την ανάπτυξη και λειτουργία του νευρικού συστήµατος του εντόµου. In silico ανάλυση της αµινοξικής ακολουθίας της Puckered έδειξε εννέα πιθανές θέσεις MAPK-εξαρτώµενης φωσφορυλίωσης, γεγονός που µας ώθησε να εξετάσουµε κατά πόσο η Puckered φωσφορυλιώνεται από αυτή την κατηγορία κινασών. Για τον σκοπό αυτό εκφράσαµε την Puckered στο ετερόλογο σύστηµα της κυτταρικής σειράς HEK293 και επιδράσαµε στα κύτταρα µε αρσενικό νάτριο προκειµένου να επάγουµε την ενεργότητα των ΜAPKs. Το αρσενικό νάτριο είναι ισχυρός επαγωγέας συνθηκών οξειδωτικού στρες στο κύτταρο και ενεργοποιεί κατά κύριο λόγο τις SAPKs, ενώ, σε µικρότερο βαθµό, ενεργοποιούνται και οι κινάσες ERK1/2. Η επίδραση µε αρσενικό νάτριο σε κύτταρα, που είχαν υποστεί διαµόλυνση ώστε να εκφράζουν την Puckered, είχε ως αποτέλεσµα την επιβράδυνση της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας της Puckered σε αποδιατακτικά πηκτώµατα ακρυλαµιδίου. Η εν λόγω αλλαγή στην ηλεκτροφορητική συµπεριφορά της Puckered οφείλονταν σε φωσφορυλίωση του µορίου της, όπως διαπιστώσαµε µετά από επίδραση µε το ένζυµο λφωσφατάση σε ανοσο-κατακρηµνίσµατα της πρωτεΐνης, τα οποία είχαν προκύψει από εκχυλίσµατα κυττάρων που συν-έκφραζαν την Puckered µε την ενεργό µορφή της κινάσης JNK. Η συν-έκφραση της Puckered µε τις συνεχώς ενεργές µορφές των κινασών JNK και p38, στα κύτταρα ΗΕΚ293, οδηγεί σε φωσφορυλίωση του µορίου της, ενώ αντίθετα, η επαγωγή της ενεργότητας των ERK, µετά από διέγερση των κυττάρων µε τον επιδερµικό αυξητικό παράγοντα, δεν είχε καµία επίδραση στο µόριο της Puckered. Επιπροσθέτως, η ταυτόχρονη αναστολή των κινασών JNK και p38, µε χρήση των χηµικών αναστολέων SP600125 και SB203580, µείωσε σηµαντικά τα επίπεδα της επαγόµενης από αρσενικό νάτριο φωσφορυλίωσης της Puckered, ενώ η παρεµπόδιση της ενεργοποίησης των ERK1/2 µέσω του αναστολέα PD98059 δεν επέφερε καµία αλλαγή στα επίπεδα φωσφορυλίωσης του µορίου της. Συνεπώς από τα αποτελέσµατα αυτών των πειραµάτων οδηγηθήκαµε στο συµπέρασµα ότι η Puckered φωσφορυλιώνεται από τις κινάσες JNK και p38 σε συνθήκες οξειδωτικού στρες επαγόµενου από αρσενικό νάτριο. Η ανάλυση ανοσο-κατακρηµνισµάτων της Puckered µέσω φασµατογραφίας µαζών οδήγησε στην ανίχνευση φωσφορυλίωσης του καταλοίπου σερίνης της θέσης 413, η οποία ωστόσο ανιχνεύθηκε τόσο παρουσία όσο και απουσία συνθηκών οξειδωτικού στρες. Βάση της παρατηρούµενης επιβράδυνση της Puckered σε συνθήκες οξειδωτικού στρες, εικάζουµε ότι η θέση φωσφορυλίωσης στο κατάλοιπο σερίνης 413, δεν είναι µοναδική και ότι πιθανώς υπάρχουν και άλλες θέσεις, οι οποίες διέφυγαν ανίχνευσης στο σύστηµα µας. Στη συνέχεια, προκειµένου να εξετάσουµε την επίδραση της φωσφορυλίωσης στη δράση της Puckered εξετάσαµε τόσο την αλληλεπίδραση της µε τις SAPKs όσο και την ενεργότητα της έναντι της JNK. H αλληλεπίδραση της Puckered µε την κινάση p38 ανιχνεύθηκε τόσο υπό φυσιολογικές όσο και υπό συνθήκες οξειδωτικού στρες, αν και σε συνθήκες στρες ήταν ενισχυµένη. Αντίθετα, η αλληλεπίδραση της Puckered µε την κινάση JNK ήταν ανιχνεύσιµη µόνο σε συνθήκες οξειδωτικού στρες. Συνεπώς η Puckered αλληλεπιδρά µε τις SAPKs ενώ η αλληλεπίδραση ενισχύεται σε συνθήκες οξειδωτικού στρες. Τέλος, σε πειράµατα όπου η επίδραση µε αρσενικό νάτριο στα κύτταρα πραγµατοποιήθηκε για διαφορετικούς χρόνους επώασης, παρατηρήσαµε ότι η φωσφορυλίωση της Puckered γίνεται σταδιακά φτάνοντας στο µέγιστο σηµείο της στα 60 λεπτά επώασης. Η σύγκριση των επιπέδων ενεργοποίησης της κινάσης JNK παρουσία και απουσία τις Puckered, στους ίδιους χρόνους επώασης, έδειξε ότι η παρουσία της Puckered επιφέρει στατιστικά σηµαντική µείωση των επιπέδων ενεργοποίησης της JNK, η οποία όµως είναι ορατή µέχρι τα 60 λεπτά επώασης, δηλαδή µέχρι τη χρονική στιγµή όπου παρατηρείται το µέγιστο της φωσφορυλίωσης του µορίου της. Συνεπώς, η φσωφορυλίωση της Puckered πιθανώς να επηρεάζει αρνητικά την δράση της ως φωσφατάση. Με στόχο την in vivo µελέτη της Puckered κατά την ανάπτυξη και λειτουργία του νευρικού συστήµατος της Drosophila melanogaster, προχωρήσαµε στην ανάπτυξη των κατάλληλων εργαλείων. Αρχικά δηµιουργήσαµε διαγονιδιακές σειρές σιώπησης, οι οποίες θα µας επέτρεπαν την χωροχρονικά κατευθυνόµενη σιώπηση του γονιδίου puckered στη Drosophila, ενώ τη συνέχεια, αναπτύξαµε πολυκλωνικό ορό έναντι του καρβοξυ-τελικού τµήµατος της πρωτεΐνης µε στόχο την ανίχνευση του ενδογενούς µορίου στους ιστούς του εντόµου. Η σιώπηση του γονιδίου puckered σε όλους τους µετα-µιτωτικούς νευρώνες του εντόµου, τόσο κατά τη διάρκεια της εµβρυϊκής ανάπτυξης όσο και κατά τα αναπτυξιακά στάδια της προνύµφης 1ου και 2ου σταδίου, είχε ως αποτέλεσµα την κατά 100% θνησιµότητα του οργανισµού. Ο χαρακτηρισµός του φαινοτύπου σε έµβρυα στα οποία είχε προηγηθεί σιώπηση του γονιδίου puckered σε όλους του µετα-µιτωτικούς νευρώνες έδειξε αλλοιώσεις στην µορφολογία τόσο του αξονικού ικριώµατος στο Κεντρικό Νευρικό Σύστηµα (ΚΝΣ), όσο και στην δοµή των περιφερικών νεύρων. Αντίστοιχος ήταν ο φαινότυπος της σιώπησης του γονιδίου puckered στα κύτταρα της µέσης γραµµής του ΚΝΣ. Η γενετική ανατοµή της εν λόγω κυτταρικής οµάδας έδειξε ότι το puckered κατέχει ρόλο στους νευρώνες και όχι στα γλοιακά κύτταρα της µέσης γραµµής. Τα αποτελέσµατα αυτά ενισχύονται και από την µελέτη του προτύπου έκφρασης του puckered στο εµβρυϊκό νευρικό σύστηµα, όπου δεν εντοπίστηκε έκφραση του γονιδίου σε γλοιακά κύτταρα. Αντίθετα, η ανάλυση εµβρύων σειρών αναφοράς του puckered έδειξε ότι το εν λόγω γονίδιο εκφράζεται σε συγκεκριµένους πληθυσµούς νευρώνων, τόσο στην κοιλιακή νευρική χορδή όσο και στο περιφερικό νευρικό σύστηµα. Συγκεκριµένα, η έκφραση του puckered ανιχνεύθηκε στου κινητικούς νευρώνες aCC/RP2 και U, καθώς και τους ενδιάµεσους νευρώνες pCC και EL. Ο ανοσο-εντοπισµός της ενδογενούς Ρuckered µε τον πολυκλωνικό ορό που αναπτύξαµε απέδωσε σήµα στις διαµήκεις και εγκάρσιες συνδετικές οδούς του αξονικού ικριώµατος, υποδεικνύοντας τον πιθανό ρόλο της Ρuckered στους άξονες. Αξίζει να σηµειωθεί, ότι το πρότυπο έκφρασης του puckered είναι δυναµικό και αυξάνει σε πολυπλοκότητα κατά τη εξέλιξη της εµβρυϊκής ανάπτυξης. Τέλος, διαπιστώσαµε ότι το puckered εκφράζεται και στο ΚΝΣ του ενηλίκου της Drosophila, όπου εντοπίζεται τόσο σε νευρικά όσο και σε γλοιακά κύτταρα. Η διακοπή της νευροδιαβίβασης στο κύκλωµα των νευρώνων που εκφράζουν το puckered οδηγεί σε παράλυση του εντόµου.