Χαρτογράφηση του γονιδίου του Activin-like Kinase 1 υποδοχέα στις ελληνικές οικογένειες με αιμορραγική τηλαγγειεκτασία

Abstract

Identified almost a century ago, hereditary hemorrhagic telangiectasia (HHT), or Osler -Rendu-Weber syndrome, was considered for a long period of time a rare disease that causes only a few unpleasant symptoms, to the infected people. The recognized manifestations of HHT are all due to abnormalities of the vascular structure and vessel construction. Patients present a wide range of clinical symptoms, whereas clinical manifestations highly vary between families and between members of a family as well. The variety of clinical symptoms of hereditary hemorrhagic telangiectasia includes vascular malformations (AVMs) at the nasal and oral mucosa, skin, brain, gastrointestinal tract, liver and lungs. HHT is genetically heterogeneous and discriminates in HHT-1, HHT-2 and HHT-3, according to mutations in the endoglin (ENG), activin A type II receptor (ACVRL1) and SMAD4 genes, respectively. Aim of the present study is to determine mutations, new or already described, in the ACVRL1 gene and to investigate the responsibility of the identified mutations for the HHT appearance in Greek patients. Patients, that came to the University Hospital of Larissa for physical examination, between the years 2007-2011, were participated in this study. All 19 patients are coming from the area of Thessaly (average age ±65). Informal consent was given from all patients to participate to the study. Peripheral blood was collected from patients and DNA was isolated using the phenol-chloroform-isoamyle alcohol method. Exons of the responsible genes were amplified using the PCR technique. ACVRL1 gene consists of 9 exons, in which all known mutations have been found. Flanking primers of every exon was used for the PCR amplification, that were designed in our laboratory, according to the nucleotide sequence, of the ACVRL1 gene existing to the GenBank (ACVRL1 – OMIM: 601284; 600376; GenBank: NG_009549.1, NM_000020.2). Nested PCR was used occasionally for further amplification on a certain PCR product. Finally, the Sanger sequencing method was used to identify the DNA primary nucleotide sequence. A point, T to C, substitution was found in the intronic sequence between exons 3 and 4, 11 bases downstream of the exon 3, in family 8. This change requires deeper investigation as it is not referred neither as a hazardous mutation nor as a benign one. A point, T to C, substitution was found at the 237 nucletide position of exon 7 in families 2, 3, 4, 5 and 6. Further investigation of this alteration needs to be done to identify if it is a hazardous mutation or not.

Προσδιορισμένη σχεδόν έναν αιώνα πριν η κληρονομική αιμορραγική τηλαγγειακτασία (ΗΗΤ) ή νόσος Rendu –Osler –Weber, θεωρούνταν για πολύ καιρό μία σπάνια περίπτωση. που προκαλεί ελάχιστα δυσάρεστα συμπτώματα στα προσβεβλημένα άτομα. Οι αναγνωρισμένες εκδηλώσεις της κληρονομικής αιμορραγικής τηλαγγειακτασίας οφείλονται όλες σε ανωμαλίες της κατασκευής και της δομής των αγγείων. Οι πάσχοντες παρουσιάζουν μεγάλο εύρος συμπτωμάτων, ενώ οι κλινικές εκδηλώσεις συχνά διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των οικογενειών, αλλά και μεταξύ των μελών της ίδιας οικογένειας. Οι ποικίλες κλινικές εκδηλώσεις της κληρονομικής αιμορραγικής τηλαγγειακτασίας περιλαμβάνουν αγγειακές διαταραχές (AVMs) στο ρινικό και στοματικό βλεννογόνο, στο δέρμα, στον εγκέφαλο, στον γαστρεντερικό βλεννογόνο, στο ήπαρ και στους πνεύμονες (PAVMs). Η HHT είναι γενετικά ετερογενής και διακρίνεται σε HHT-1 και HHT-2 και HHT-3, σύμφωνα με μεταλλάξεις στο γονίδιο της ενδογλίνης (ENG), στο γονίδιο ακτιβίνης Α υποδοχέα τύπου ΙΙ (ACVRL1) στο γονίδιο SMAD4, αντίστοιχα. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η αναζήτηση παρόμοιων μεταλλάξεων ή και νέων, να ερευνηθεί αν οι μεταλλάξεις στο γονίδιο ACVRL1 που έχουν ήδη ταυτοποιηθεί είναι υπεύθυνες για την Κληρονομική Αιμορραγική Τηλαγγειεκτασία Τύπου 2, που παρουσιάζουν οι ασθενείς στην Ελλάδα. Χρησιμοποιήθηκαν ασθενείς που προσήλθαν στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Λάρισας το χρονικό διάστημα 2007-2011. Οι 14 ασθενείς κατάγονται από τη Θεσσαλία. (διάμεση ηλικία ±65 έτη). ¨Ολοι οι ασθενείς έδωσαν την συγκατάθεση συμετοχής στην μελέτη. Συλλέχθηκε ολικό αίμα και ακολούθησε απομόνωση του DNA με τη μέθοδος της φαινόλης-χλωροφόρμιου-ισοαμυλικής αλκοόλης. Ακολούθησε πολλαπλασιασμός των εξονίων των υπεύθυνων γονιδίων με την μέθοδο της PCR. Το γονίδιο ACVRL1 αποτελείται από 9 εξόνια, όπου σε όλα έχουν εντοπιστεί οι έως τώρα γνωστές μεταλλάξεις. Για την διαδικασία της PCR χρησιμοποιήθηκαν περιβάλλοντες εκκινητές (flanking primers) για το κάθε εξόνιο, που έχει σχεδιαστεί στο εργαστήριό μας με βάση τις αλληλουχίες των γονιδίων ACVRL1 που έχουν καταχωρηθεί στην GenBank (ACVRL1 – OMIM: 601284; 600376; GenBank: NG_009549.1, NM_000020.2). Σε μερικά από τα εξόνια χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της nested PCR, για περαιτέρω ενίσχυση του προϊόντος. Για τον προσδιορισμό της πρωτοταγούς νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του DNA εφαρμόστηκε η ενζυμική μέθοδος κατά Sanger.Διαπιστώθηκε μια αντικατάσταση βάσης Τ από C, στη θέση 11 του ιντρόνιου 3, στην οικογένεια 8. Αυτή η αλλαγή χρήζει μελέτης καθώς δεν αναφέρεται ως παθογόνος ή μη.Διαπιστώθηκε μια αντικατάσταση βάσης T από C, στη θέση 237 του εξονίου 7 στις οικογένειες 2 3, 4, 5 και 6. Αυτή η μετάλλαξη χρήζει βαθύτερης μελέτης σε μοριακό επίπεδο προκειμένου να διαπιστωθεί κατά πόσο είναι παθογόνος μετάλλαξη ή όχι.