Μελέτη του ρόλου της ενδοθηλίνης και των υποδοχέων της στην επιθηλιομεσεγχυματική μετατροπή στο αδενοκαρκίνωμα του προστάτη

Abstract

Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT) is part of a mechanism that is physiologically activated during embryogenesis and wound healing. EMT is a molecular mechanism that, as indicated by its name, confers mesenchymal properties on epithelial cells, such as increased invasiveness and migration, making it a process closely associated with acquisition of aggressive traits by carcinoma cells.The endothelin axis plays a central role in neoplasia, with endothelin 1 (ET-1) mediating a mitogenic effect on epithelial or other carcinomas through its receptors A(ET-A) and B (ET-B). Activation of the endothelin axis induces proliferation,apoptosis resistance and new vessel formation and also modulates immune responses and drug resistance.In the present study the expression of molecular markers modulated during EMT and their possible relationship with the endothelin axis was investigated by immunohistochemistry in prostate cancer. Antibodies for the adherence molecules, E and N-cadherins, transcription factor SNAIL as well as for the endothelin ET-1 and its receptors ET-A and ET-B were used. The tissue samples were obtained from 87 patients with prostate cancer, between the ages of 51 and 75. The expression of the investigated molecules was estimated in neoplasm tissue (cancer cells) and in the adjacent “non-neoplastic” tissue, whereas the cellular localization (membrane,cytoplasm, nucleus) was determined. The patient’s samples were categorized according to: age, Gleason score (Grade I, Gleason score 2-6, Grade II, Gleason scοre 7 (3+4 ή 4+3), Grade III, Gleason scοre 8-10), stage Τ and Ν (presence or not of positive lymph nodes).In the adjacent “normal” non neoplastic epithelium the expression of E cadherin and b-catenin was strong at the membrane, with N-cadherin being expressed in medium levels at the membrane as well as the cytoplasm and SNAIL showing low nuclear levels. In accordance, vimentin was negative in all samples, while ET-1 andET-A were present in the cytoplasm at low levels.In contrast, in prostate carcinoma E- and N-cadherin were low at the membrane and medium to high at the cytoplasm, together with b-catenin that was also reduced at the membrane, but was increased in the cytoplasm and the nucleus.Vimentin was positive in the cancer cells and SNAIL was present at medium to high levels in the nucleus of the cancer cells. ET-1 and ET-A were located with increased levels in the cytoplasm of the cancer cells, whereas ET-B was negative for all samples.The statistical analysis indicated significant associations between the markers of EMT and the endothelin axis with the clinocopathological characteristics (lymph node,T stage and Gleason Score). The increased nuclear levels of Snail and the cytoplasmic levels of ET-1 and ET-A were associated with all the investigated clinicalparameters. The expression of N-cadherin at the cytoplasm and the membrane significantly correlated with the presence of lymph nodes and T stage of the tumor,whereas cytoplasmic b-catenin correlated with the lymph node status and cytoplasmic E-cadherin with the Gleason score.Furthermore, nuclear E-cadherin positively correlated with the expression of E-cadherin in both the cytoplasm and the membrane, with E-cadherin levels at thecytoplasm being positively correlated with the expression of ET-1 and ET-A. In this respect, ET-1 positively correlated with cytoplasmic b-catenin and negatively correlated with her expression at the membrane, while SNAIL showed a positive correlation with the expression of ET-1 and ET-A. In conclusion, in the present study the existence of EMT and its association with the ET-1/ET-A axis was verified in prostate cancer. The transcription factor SNAIL seems to play a pivotal role in the crosstalking of these two pathways. The increased expression of the EMT markers as well as those of SNAIL, ET-1/ET-A correlated with lymph node, stage T and Gleason score. These findings make the prospect of molecular cancer staging attractive and emphasize the rationale of the development of new therapeutic approaches with specific EMT /endothelin axis inhibitors in the treatment of prostate cancer.

Η επιθήλιο-μεσεγχυματική μετατροπή (ΕΜΤ) αποτελεί ένα φυσιολογικό μηχανισμό που ενεργοποιείται κατά την εμβρυογένεση και την επούλωση τραυμάτων. Είναι ένας μοριακός μηχανισμός που συμβάλει στην μετατροπή των επιθηλιακών κυττάρων σε μεσεγχυματικά, προσδίδοντας τους χαρακτηριστικά όπως αυξημένη διεισδυτικότητακαι κινητικότητα, κάνοντάς τη έτσι μία διαδικασία που παίζει επιπλέον κεντρικό ρόλο στην μετατροπή και μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων.Σημαντικό ρόλο στη νεοπλασία παίζει και ο άξονας των ενδοθηλινών, όπου η ενδοθηλίνη 1 (ΕΤ-1) μέσω των υποδοχέων της Α (ΕΤ-Α) και Β (ΕΤ-Β) διαμεσολαβεί στη μιτογόνο ενίσχυση των επιθηλιακών και μη- καρκινωμάτων. Η ενεργοποίηση του άξονα μπορεί να επάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την κυτταρική επιβίωση,την ΕΜΤ, τη νεοαγγειογένεση, την ανοσοαπόκριση και την αντίσταση σε φάρμακα. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε με ανοσοϊστοχημική μέθοδο σε αδενοκαρκινώματα του προστάτη η έκφραση μορίων που μεταβάλλονται κατά τη διεργασία της ΕΜΤ και εξετάστηκε η πιθανή συσχέτιση τους με γνωστούς παράγοντες του άξονα των ενδοθηλινών. Χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα για τους παράγοντες προσκόλλησης, Ε- και Ν-καντχερινών και σύνδεσης των κυττάρων, β-κατενίνη, του μεταγραφικού παράγοντα SNAIL, καθώς και παράγοντες του άξονα των ενδοθηλινών, την ΕΤ-1 και τους υποδοχείς της ΕΤ-Α και ΕΤ-Β. Τα ιστικά δείγματα προήλθαν από 87 ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του προστάτη, ηλικίας από51 έως 75 ετών. Η έκφραση των υπό μελέτη παραγόντων εκτιμήθηκε τόσο στο νεοπλασματικό ιστό (καρκινικά κύτταρα), όσο και στον παρακείμενο μη νεοπλασματικό ιστό, ενώ εκτιμήθηκε η ακριβής εντόπιση των παραγόντων(μεμβράνη, κυτταρόπλασμα, πυρήνας). Τα δείγματα των ασθενών κατηγοριοποιήθηκαν ως προς τους παράγοντες: ηλικία, βαθμό ιστολογικής διαφοροποίησης (Gleason score: Grade I, συνδυασμένο Gleason score 2-6, Grade II,συνδυασμένο Gleason scοre 7 (3+4 ή 4+3), Grade III, συνδυασμένο Gleason scοre 8-10), στάδιο Τ (μέγεθος όγκου) και Ν (παρουσία ή μη λεμφαδενικών μεταστάσεων).Στον «φυσιολογικό» μη νεοπλασματικό αδενικό επιθήλιο η έκφραση της Ε-καντχερίνης και της β-κατενίνης ήταν ισχυρή και μεμβρανική, με την Ν-καντχερίνηνα βρίσκεται σε μέτρια επίπεδα τόσο στην μεμβράνη όσο και το κυτταρόπλασμα καιτο SNAIL να παρουσιάζει χαμηλά επίπεδα στον πυρήνα. Αντίστοιχα, η βιμεντίνη ήταν αρνητική σε όλα τα περιστατικά, ενώ η ΕΤ-1 και ο ΕΤ-Α, εντοπίζονταν στοκυτταρόπλασμα σε χαμηλά επίπεδα. Αντίθετα, στο αδενοκαρκίνωμα του προστάτη η Ε-καντχερίνη και η Ν-καντχερίνη ήταν σε χαμηλά επίπεδα στην μεμβράνη και σε μέτρια με υψηλά επίπεδα στο κυτταρόπλασμα, σε συνδυασμό με την β-κατενίνη που επίσης βρισκόταν μειωμένη στην μεμβράνη και αυξημένη στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα. Η βιμεντίνη είχε θετική χρώση στα νεοπλασματικά κύτταρα και ο μεταγραφικός παράγοντας SNAIL ήταν σε μέτρια προς υψηλά επίπεδα στον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων. Η ΕΤ-1 και ο ΕΤ-Α αυτά εντοπίστηκαν σε αυξημένα επίπεδα στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων, ενώ ο ΕΤ-Β ήταν αρνητικός σε όλα τα περιστατικά.Η στατιστική ανάλυση ανέδειξε σημαντική σχέση των δεικτών ΕΜΤ και του άξονα των ενδοθηλινών με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά (λεμφαδενική διήθηση, μέγεθος Τ όγκου και βαθμό διαφοροποίησης Gleason). Αυξημένα επίπεδα πυρηνικής έκφρασης του SNAIL και κυτταροπλασματικής έκφρασης της ΕΤ-1 και του ΕΤ-Α σχετίζονταν με όλες της κλινικοπαθολογικές παραμέτρους. Η μεμβρανική και η κυτταροπλασματική έκφραση της Ν-καντχερίνης σχετιζόταν σημαντικά με τη λεμφαδενική διήθηση και το μέγεθος του όγκου, ενώ η κυτταροπλασματική β-κατενίνη με τη λεμφαδενική διήθηση και η κυτταροπλασματική Ε-καντχερίνη με το βαθμό διαφοροποίησης. Επιπλέον, η πυρηνική Ε-καντχερίνη συσχετιζόταν θετικά με την κυτταροπλασματική και μεμβρανική έκφραση της Ν-καντχερίνης, ενώ η κυτταροπλασματική της έκφραση συσχετιζόταν θετικά με τα επίπεδα έκφρασης της ΕΤ-1 και του υποδοχέα της ΕΤ-Α. Αντίστοιχα, η ΕΤ-1 σχετιζόταν θετικά με τα επίπεδα της κυτταροπλασματικής έκφρασης της β-κατενίνης και αρνητικά με τα επίπεδα της στην μεμβράνη ενώ ο SNAIL σχετιζόταν θετικά με την έκφραση των ΕΤ-1 και ΕΤ-Α.Συμπερασματικά, επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη ΕΜΤ στο αδενοκαρκίνωμα του προστάτη και η συσχέτισή της με τον άξονα ΕΤ-1/ΕΤ-Α. Ο μεταγραφικός παράγοντας SNAIL παίζει βασικό ρόλο στη συνομιλία των δύο μονοπατιών. Η αυξημένη έκφραση των δεικτών ΕΜΤ αλλά και των Snail, ΕΤ-1/ΕΤ-Α σχετίζεται μετη λεμφαδενική διήθηση, το μέγεθος Τ του όγκου και το βαθμό διαφοροποίησης. Τα ευρήματα αυτά κάνουν ελκυστική την προοπτική πιθανής χρήσης των ανωτέρω μορίων ως εργαλεία μοριακής σταδιοποίησης αλλά και υπογραμμίζουν τη λογική ανάπτυξης θεραπειών με χρήση ειδικών αναστολέων στην αντιμετώπιση του αδενοκαρκινώματος του προστάτη.