Μοριακή μελέτη βασικοκυτταρικών καρκινωμάτων δέρματος

Abstract

Introduction: Basal Cell Carcinoma (BCC) is the most common malignant skin neoplasm developing slowly and metastasizing rarely. Sun overexposure (ultraviolet irradiation - UV), race, age, sex as well as genetic factors contribute to the development of Basal Cell Carcinoma. Aim: The aim of the present study was to investigate the role of mismatch repair system (MMR) deficiency regarding oncogenesis of Basal Cell Carcinoma of the skin, through the analysis of microsatellite instability (MSI), the study of expression levels of fundamental mismatch repair genes - hMLH1 and hMSH2 - and the detection of alterations in microsatellites located in coding regions of five genes, TGF-βRII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6 και Caspase 5 that are known targets for mutations in MSI-high tumors. We further studied the expression of p53 protein on this neoplasia, as p53 gene is a major target of UV for BCC induction. Finally we investigated the presence of B-Raf mutations in BCCs, a gene that is related to Ras signalling pathway which is known to be involved in the pathogenesis of cutaneous tumours such as squamous cell carcinonomas (SCC) and malignant melanomas. The objective of this study was to evaluate any correlation of our findings with the clinicopathological features of the analyzed Basal Cell Carcinomas. Material and Methods: A total of 84 specimens from patients diagnosed with BCC were studied. For MSI assessment the mononucleotide microsatellite markers, BAT25, BAT-26 and ΒΑΤ40 and the dinucleotide markers D2S123, D5S346, D17S250 were analyzed elaborating polymerase chain reaction (PCR) and electrophoresis on 25% polyacrylamide gel, followed by silver staining. Mutations in short repetitive coding sequences within the known target genes of MSI, TGF-βRII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6 και Caspase 5, as well as mutations in the B-Raf gene were investigated using PCR, single-stranded conformation polymorphism (SSCP) and DNA sequencing. The expression of hMLH1, hMSH2 and P53 proteins was evaluated by immunohistochemical analysis. Results: MSI was detected in 7% of the BCCs studies and the only markers altered were the mononucleotide ones, BAT26 and BAT25. Frameshift mutations in the (A)10 tract of the TGF-bRII were identified in 5% of the cases. In four out of the eighty four BCCs (5%) the (A)8 tract of the hMSH3 gene was altered. One of those cases was also altered in the (A)10 tract of Caspase 5. No mutations were observed in the (G)8 tract of IGFIIR or in the (C)8 tract of hMSH6. B-Raf mutations were detected in two cases out of the eighty four BCCs examined: a T to A transversion at nucleotide 1829 (c.1829T>A) leading to an exchange from phenylalanine to isoleucine p.(F610I) and a C to T transition at 1790 nucleotide (c.1790C>T) leading however to a silent mutation p.(L597L). The common V600E point mutation was not detected in any BCC sample. Analysis of correlation between the above mentioned parameters with the clinicopathological features of the BCCs such as the histological subtypes or the aggressiveness of the carcinomas revealed no considerable associations. Conclusions: Our results suggest that MSI appears to play a minor role in the pathogenesis of BCCs. Moreover, no correlation between MSI and hMLH1, hMSH2 or p53 protein expression was determined. Furthermore, changes in repetitive sequences of MSI target genes are uncommon in non-melanoma skin cancer occurring in a minor subgroup of BCCs not always in association with MSI. B-Raf is rarely mutated in BCC and none of the studied BCC harboured the most frequent mutation V600E. The role of microsatellite instability in the carcinogenesis of Basal Cell Carcinoma mandates further study focusing on the analysis of additional mononucleotide markers as well as additional MSI target genes. Finally, the implication of the MAP kinase Raf/MEK/ERK signalling pathway in the pathogenesis of BCC at the levels of MEK and ERK MAP kinases is also worth investigating.

Εισαγωγή: Το βασικοκυτταρικό καρκίνωμα (Basal Cell Carcinoma) είναι το πιο συχνό κακόηθες δερματικό νεόπλασμα το οποίο αναπτύσσεται αργά και σπάνια μεθίσταται. Η υπερβολική έκθεση στον ήλιο (υπεριώδης ακτινοβολία), η φυλή, η ηλικία, το φύλο καθώς και γενετικοί παράγοντες συμβάλλουν στην ανάπτυξη του βασικοκυτταρικού καρκινώματος. Σκοπός: Σκοπός της εργασίας αυτής ήταν η αναζήτηση του ρόλου της ανεπάρκειας του επιδιορθωτικού μηχανισμού MMR (mismatch repair) στην καρκινογένεση του βασικοκυτταρικού καρκινώματος του δέρματος, μέσω ανίχνευσης μικροδορυφορικής αστάθειας (microsatellite instability, MSI), μελέτης των επιπέδων έκφρασης των βασικών γονιδίων επιδιόρθωσης (MMR) hMLH1, hMSH2 και αναζήτησης μεταλλαγών στις κωδικές μικροδορυφορικές μονονουκλεοτιδικές αλληλουχίες των γονιδίων στόχων της μικροδορυφορικής αστάθειας TGF-βRII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6 και Caspase 5. Μελετήθηκε επίσης η έκφραση της πρωτεΐνης p53 η οποία σχετίζεται με την εμφάνιση του βασικοκυτταρικού καρκινώματος και τέλος η παρουσία μεταλλαγών στο εξώνιο 15 του γονιδίου B-Raf το οποίο σχετίζεται με το σηματοδοτικό μονοπάτι Ras το οποίο μονοπάτι είναι γνωστό πως συνδέεται με την παθογένεση όγκων του δέρματος όπως είναι τα ακανθοκυτταρικά καρκινώματα (squamous cell carcinonomas, SCCs) και τα κακοήθη μελανώματα. Στόχος της μελέτης είναι η σύγκριση των ευρημάτων με τα κλινικά και παθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των υπό μελέτη βασικοκυτταρικών καρκινωμάτων. Υλικό και Μέθοδοι: Μελετήθηκαν συνολικά 84 δείγματα από ασθενείς με βασικοκυτταρικό καρκίνωμα. Για την ανίχνευση της μικροδορυφορικής αστάθειας αναλύθηκαν οι μικροδορυφορικοί δείκτες BAT25, BAT26, ΒΑΤ40 (μονονουκλεοτιδικοί δείκτες) και D2S123, D5S346, D17S250 (δινουκλεοτιδικοί δείκτες) με εφαρμογή των μεθόδων αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και κάθετη ηλεκτροφόρηση. Για την ανίχνευση μεταλλαγών στα γονίδια στόχους της μικροδορυφορικής αστάθειας TGF-βRII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6 και Caspase 5 και του γονιδίου B-Raf, εφαρμόστηκαν οι μέθοδοι PCR και πολυμορφισμοί διαμόρφωσης μονόκλωνης αλυσίδας (SSCPs). Στην περίπτωση ανίχνευσης μεταλλαγής ακολούθησε ταυτοποίηση με τη μέθοδο της αλληλούχισης κατά Sanger (sequencing). Η έκφραση των πρωτεϊνών hMLH1, hMSH2 και p53 εκτιμήθηκε ανοσοϊστοχημικά. Αποτελέσματα: Μικροδορυφορική αστάθεια ανιχνεύτηκε σε ποσοστό 7% των βασικοκυτταρικών καρκινωμάτων. Οι αλλαγές που παρατηρήθηκαν αφορούσαν μόνο στους μονονουκλεοτιδικούς δείκτες BAT26 και BAT25. Σε ποσοστό 5% των περιπτώσεων παρατηρήθηκε μεταλλαγή στην επαναλαμβανόμενη αλληλουχία των 10 αδενίνων του γονιδίου TGF-βRII. Εξέταση του μονονουκλεοτιδικού τμήματος των 8 αδενίνων στο γονίδιο hMSH3 αποκάλυψε αλλαγές μήκους σε 4 από τις 84 περιπτώσεις (5%). Μία από αυτές εμφάνισε μεταλλαγή και στην επαναλαμβανόμενη αλληλουχία του γονιδίου της Caspase 5. Δεν βρέθηκαν μεταλλαγές στις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες των γονιδίων IGFIIR και hMSH6. Μεταλλαγές στο γονίδιο Β-Raf ανιχνεύθηκαν σε δύο από τις ογδόντα τέσσερις περιπτώσεις. Στην πρώτη περίπτωση παρατηρήθηκε σημειακή μεταλλαγή στο νουκλεοτίδιο 1829 και συγκεκριμένα η μεταστροφή Τ→Α (c.1829T>A) που οδηγεί σε αντικατάσταση της φαινυλαλανίνης από ισολευκίνη p.(F610I) στην πρωτεΐνη B-Raf. Στη δεύτερη περίπτωση παρατηρήθηκε η μετάπτωση C→Τ στο νουκλεοτίδιο 1790 (c.1790C>T) το οποίο οδηγεί στη σιωπηλή μεταλλαγή p.(L597L). Σε κανένα από τα δείγματα δεν ανιχνεύθηκε η μεταλλαγή p.(V600E), η πιο συχνά παρατηρούμενη μεταλλαγή του εξωνίου 15 του B-Raf. Δεν ανιχνεύτηκε καμία στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ των υπό μελέτη παραμέτρων με τους ιστολογικούς υπότυπους του βασικοκυτταρικού καρκινώματος, με την επιθετικότητα των καρκινωμάτων ή με άλλα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά. Συμπεράσματα: Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε πως η μικροδορυφορική αστάθεια φαίνεται να παίζει περιορισμένο ρόλο στην καρκινογένεση του βασικοκυτταρικού καρκινώματος. Επιπλέον δε συσχετίζεται με την έκφραση των πρωτεϊνών hMLH1, hMSH2 και p53 πρωτεϊνών. Μεταλλαγές στα γονίδια στόχους της μικροδορυφορικής αστάθειας φαίνεται να συμβαίνουν σε συγκεκριμένες περιπτώσεις βασικοκυτταρικών καρκινωμάτων οι οποίες δε σχετίζονται πάντα με την ύπαρξη μικροδορυφορικής αστάθειας. Μεταλλαγές στο γονίδιο B-Raf σπάνια παρουσιάζονται στα βασικοκυτταρικά καρκινώματα και κανένα από τα υπό μελέτη βασικοκυτταρικά καρκινώματα δεν παρουσίασε τη πιο συχνή μεταλλαγή V600E. Προτείνεται η ανάλυση περισσότερων μονονουκλεοτιδικών δεικτών για την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου της μικροδορυφορικής αστάθειας στην ανάπτυξη του βασικοκυτταρικού καρκινώματος καθώς και η ανάλυση επιπρόσθετων γονιδίων στόχων. Προτείνεται η διερεύνηση της εμπλοκής του μονοπατιού μεταγωγής σήματος των MAP κινασών Raf/MEK/ERK στα επίπεδα των MEK και ERK MAP κινασών.