Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών του ενδοσυμβιωτικού ιού του παρασιτοειδούς υμενοπτέρου Cotesia congregata με πρωτεΐνες της ανοσολογικής απόκρισης των λεπιδοπτέρων

Abstract

Polydnaviruses (PDVs) are endosymbiotic viruses of parasitoid Hymenoptera. Their particles are injected together with the endoparasitoid’s eggs in the final lepidopteran host, where the viral genes are transcribed. The expressed proteins mediate a series of changes in the host’s physiology, such as developmental delay and immune suppression, thus protecting the hymenopteran embryos from host reactions.The objective of this thesis was to study members of the Ankyrin-repeat protein family, Ank proteins, of the CcBV polydnavirus (Cotesia congregata bracovirus), which lives as a provirus in the hymenopteran species Cotesia congregata, a wasp known to parasitize larvae of the lepidopteran Manduca sexta. CcBV Ank proteins are homologous to ΙκΒ molecules and, therefore, could function as inhibitors of Rel/NF-κΒ transcription factors. Six out of nine CcBV ank genes were subcloned to lepidopteran-specific expression vectors and expressed in insect cells in order to make a comparison among their encoded products. Using transient transfections and subsequent Western immunoblotting, expression levels of the different Ank proteins were found to be unequal, whereas according to immunofluorescence experiments, their subcellular distribution varied among the different family members and often among different cells expressing the same protein. Thus, both the expression levels and the subcellular distribution of CcBV Ank proteins seem to be under regulation.Employing functional assays we tested the effect of Ank proteins on Rel/NF-κΒ transcription factors of the domesticated silkworm Bombyx mori in a lepidopteran cell line. Rel/NF-κΒ factors regulate the transcription of genes implicated in many aspects of the insect immune system, such as antimicrobial (antimicrobial peptide synthesis), antiparasitic (melanization, encapsulation and reactive intermediates production) and antiviral responses through the Imd and Toll signalling pathways. Therefore, it is hypothesized that inhibiting Rel/NF-κΒ factors and the corresponding Imd and Toll pathways of the lepidopteran host’s immune system is crucial for the endoparasitoid’s survival. In order to examine whether CcBV Ank proteins are indeed capable of inhibiting Rel/NF-κΒ factors, and given that the corresponding genes from C. congregata’s natural host M. sexta were unavailable, we used a heterologous system that includes the Trichoplusia ni Hi5 cell line and the transiently expressed silkworm Rel/NF-κΒ transcription factors, Relish1 and RelB. In luciferase assays we examined whether the six viral Ank proteins can suppress the transcription of a firefly luciferase reporter gene placed under the control of a promoter that bears Rel/NF-κΒ binding elements. Five out of the six examined proteins inhibited transcription factor R1d2, a constitutively active Relish1 mutant that participates in the Imd signalling pathway. The inhibition of R1d2 transcriptional activity varied between the different Ank proteins and was dose-dependent for three of them. On the contrary, the transcriptional activity of RelΒ, a factor activated by the Toll pathway, was inhibited only by one out of the six Ank family members. The observed differences between the two signalling pathways suggest that different Ank proteins show specificity against their targets and imply that most CcBV Anks target the Imd pathway, indicating the importance of this pathway in anti-viral responses. Immunofluorescence experiments in Hi5 cells transiently over-expressing the viral proteins and the silkworm transcription factors revealed nuclear co-localization between transcription factor R1d2 and Ank proteins, while RelΒ co-localized with its Ank2 inhibitor in the cytoplasm. Moreover, two Ank proteins were found to interact with full-length Relish1 in pull-down experiments which, together with the R1d2 inhibition observed in the functional assays, implies that Ank proteins could act as Relish1 inhibitors in vivo.Furthermore, the possible suppression of mammalian Rel/NF-κB factors by CcBV Ank proteins was also tested. Six ank genes were subcloned in an expression vector suitable for expression in mammalian cells and the effect of the corresponding proteins on endogenous transcription factor NF-κB of HEK293 cells was examined. Tumor necrosis factor α (TNF-α) was used as an inducer of the endogenous mammalian signalling pathway that is initiated by the TNF-receptor and that corresponds to the insect Imd pathway. Our results showed that two members of the Ank protein family inhibit the TNFR pathway in HEK293 cells. Conclusively, this thesis describes the first attempt to compare multiple members of a PDV Ank family both at expression/localization level and functional level, thus giving the opportunity to comprehend the existing variation in PDV protein families. The results are in agreement with the hypothesis that polydnavirus Ankyrin-repeat proteins act as Rel/NF-κΒ inhibitors; both in lepidopteran insect cells and in mammalian cells. In fact, Ank proteins are capable of suppressing both major immune signalling pathways, Toll and Imd, in insect cells. Finally, it is evident that Ank proteins of a PDV endosymbiotic of a certain hymenopteran species can block immune regulators of the natural lepidopteran host, as well as of other Lepidoptera. Therefore, PDV proteins, like Anks, could be employed for the immune suppression of a range of insects in order to enhance the effectiveness of pest control applications involving entomopathogenic viruses, bacteria or fungi.

Οι polydna ιοί είναι μια ομάδα ιών που ενδοσυμβιώνει με ενδοπαρασιτοειδή υμενόπτερα έντομα (σφήκες) και συμμετέχει στον παρασιτισμό λεπιδοπτέρων εντόμων από τα Υμενόπτερα. Τα σωματίδια των ιών ενίονται μαζί με τα γονιμοποιημένα αυγά των σφηκών στα λεπιδόπτερα έντομα-ξενιστές. Τα γονίδια των polydna ιών εκφράζονται στα κύτταρα του λεπιδόπτερου ξενιστή και οι παραγόμενες πρωτεΐνες επιδρούν στη φυσιολογία του ξενιστή καθυστερώντας την ανάπτυξή του και καταστέλλοντας το ανοσοποιητικό του σύστημα. Με αυτόν τον τρόπο τα αυγά και τα έμβρυα της σφήκας προστατεύονται από αντιδράσεις άμυνας του ξενιστή και μπορούν να αναπτυχθούν. Στόχος της διατριβής ήταν η μελέτη μελών της οικογένειας πρωτεϊνών που περιέχουν επαναλήψεις αγκυρίνης (πρωτεΐνες Ank) του polydna ιού CcBV (Cotesia congregata bracovirus), ο οποίος ενδοσυμβιώνει με τη σφήκα Cotesia congregata και συμμετέχει στον παρασιτισμό των προνυμφών του Λεπιδοπτέρου Manduca sexta. Οι πρωτεΐνες Ank του ιού CcBV είναι ομόλογες με μόρια ΙκΒ, δηλαδή δυνητικοί αναστολείς μεταγραφικών παραγόντων τύπου Rel/NF-κΒ. Έξι γονίδια ank του CcBV υποκλωνοποιήθηκαν σε φορείς κατάλληλους για έκφραση σε κύτταρα λεπιδοπτέρων εντόμων ώστε να γίνει συγκριτική μελέτη των ιδιοτήτων των κωδικοποιούμενων πρωτεϊνών. Με παροδικές διαμολύνσεις και ανοσοαποτυπώσεις κατά Western βρέθηκε ότι τα διάφορα μέλη της οικογένειας παρουσιάζουν άνισα επίπεδα έκφρασης, ενώ πειράματα ανοσοφθορισμού ανέδειξαν ετερογένεια στον υποκυτταρικό εντοπισμό τους, με κάποιες πρωτεΐνες να απαντώνται σε περισσότερα του ενός υποκυτταρικά διαμερίσματα σε διαφορετικά κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο εντοπισμός και η έκφρασή τους υπόκεινται σε ρύθμιση.Με χρήση κατάλληλων λειτουργικών πειραμάτων, εξετάστηκε επίσης η επίδραση των πρωτεϊνών Ank στην ενεργότητα Rel/NF-κΒ παραγόντων του καλλιεργούμενου μεταξοσκώληκα Bombyx mori σε κυτταρικές σειρές λεπιδοπτέρων εντόμων. Οι παράγοντες Rel/NF-κΒ ρυθμίζουν, μέσω των οδών μεταγωγής σήματος Imd και Toll, την έκφραση γονιδίων που ελέγχουν πολλαπλές πτυχές του ανοσοποιητικού συστήματος των εντόμων, όπως την παραγωγή αντιμικροβιακών πεπτιδίων, καθώς και αποκρίσεις που αφορούν πιο άμεσα την αντιμετώπιση του παρασιτισμού, όπως η μελανοποίηση, η εγκύστωση, η παραγωγή ελευθέρων ριζών και οι αντι-ιικές αποκρίσεις. Επομένως, πιθανολογείται ότι η αναστολή των παραγόντων Rel/NF-κΒ και η συνεπαγόμενη παρεμπόδιση των σηματοδοτικών οδών Toll και Imd του ανοσοποιητικού συστήματος των λεπιδοπτέρων ξενιστών από πρωτεΐνες των polydna ιών, και ειδικότερα από τις πρωτεΐνες Ank, είναι σημαντική για την επιβίωση των παρασιτοειδών. Για να διαπιστωθεί αν η συγκεκριμένη υπόθεση ευσταθεί και με δεδομένη τη μη διαθεσιμότητα των γονιδίων Rel/NF-κΒ παραγόντων του φυσικού ξενιστή της C. congregata, M. sexta, χρησιμοποιήθηκε ένα ετερόλογο λειτουργικό σύστημα που περιέλαβε τα γονίδια των ετερόλογων μεταγραφικών παραγόντων Relish1 και RelB του B. mori, που συμμετέχουν στις οδούς μεταγωγής σήματος Imd και Toll, αντίστοιχα, σε συνδυασμό με την κυτταρική σειρά Hi5 του Λεπιδοπτέρου Trichoplusia ni. Σε λειτουργικές δοκιμασίες φωταύγειας διερευνήθηκε η επίδραση των έξι ιικών πρωτεϊνών Ank στη μεταγραφή ενός γονιδίου αναφοράς firefly luciferase, που είχε τεθεί υπό τον έλεγχο υποκινητών με στοιχεία πρόσδεσης Rel/NF-κΒ για τους δύο μεταγραφικούς παράγοντες του μεταξοσκώληκα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι πέντε από τις έξι πρωτεΐνες του CcBV που ελέγχθηκαν προκάλεσαν αναστολή στην ενεργότητα του μεταγραφικού παράγοντα R1d2, μια συστατικά ενεργή μορφή του Relish1, στο μονοπάτι Imd, με την αναστολή να είναι διαφορική για τα έξι μέλη και δοσοεξαρτόμενη για τρία μέλη της οικογένειας που εξετάστηκαν σε σχετικά πειράματα δοσοεξάρτησης. Αντίθετα, η ενεργότητα του μεταγραφικού παράγοντα RelΒ, που ενεργοποιείται από το μονοπάτι Toll, βρέθηκε να αναστέλλεται μόνο από ένα από τα έξι μέλη της οικογένειας Ank που εξετάστηκαν. Η διαφοροποίηση ανάμεσα στις δύο οδούς μεταγωγής σήματος υποδηλώνει την εξειδίκευση των διαφορετικών ιικών πρωτεϊνών Ank ως προς τα μόρια-στόχους τους και υποδεικνύει ότι τα περισσότερα μέλη στοχεύουν την οδό μεταγωγής σήματος Imd, γεγονός πιθανά ενδεικτικό του ρόλου που η συγκεκριμένη οδός διαδραματίζει στην αντι-ιική προστασία των εντόμων. Σε κύτταρα Hi5 που υπερεκφράζουν παροδικά τις ιικές πρωτεΐνες και τους μεταγραφικούς παράγοντες παρατηρήθηκε πυρηνικός συνεντοπισμός του μεταγραφικού παράγοντα R1d2 με αρκετές από τις πρωτεΐνες Ank που αναστέλλουν τη λειτουργία του, ενώ ο παράγοντας RelΒ παρουσίασε συνεντοπισμό με την πρωτεΐνη-αναστολέα του στο κυτταρόπλασμα. Επιπλέον, πειράματα συγκατακρήμνισης έδειξαν αλληλεπίδραση ανάμεσα σε δύο πρωτεΐνες Ank και τον πλήρους μήκους παράγοντα Relish1, γεγονός που, σε συνδυασμό με την αναστολή του R1d2 από τις ιικές πρωτεΐνες, υποδηλώνει ότι οι πρωτεΐνες Ank πιθανώς δρουν ως αναστολείς του Relish1 και in vivo.Στα πλαίσια της προσπάθειας για διαλεύκανση πιθανής δράσης των πρωτεϊνών Ank του CcBV σε Rel/NF-κB παράγοντες θηλαστικών, τα έξι ank γονίδια υποκλωνοποιήθηκαν σε φορέα κατάλληλο για έκφραση σε κύτταρα θηλαστικών και εξετάστηκε η δράση των αντίστοιχων πρωτεϊνών στη λειτουργικότητα του ενδογενούς μεταγραφικού παράγοντα NF-κB κυττάρων HEK293. Χρησιμοποιώντας την κυτταροκίνη TNF-α ως επαγωγέα του NF-κB, διαπιστώθηκε η ανασταλτική δράση δύο πρωτεϊνών στην ανοσολογική οδό μεταγωγής σήματος των θηλαστικών που ενεργοποιείται μέσω του υποδοχέα του παράγοντα νέκρωσης όγκων TNFR και είναι αντίστοιχη με την Imd οδό των εντόμων. Συμπεραματικά, με τις μελέτες που περιγράφονται σε αυτή τη διατριβή, επιχειρήθηκε για πρώτη φορά η σύγκριση ανάμεσα σε πολλά μέλη μιας οικογένειας πρωτεϊνών Ank των ενδοσυμβιωτικών polydna ιών σε επίπεδο έκφρασης και υποκυτταρικής κατανομής αλλά και σε λειτουργικό επίπεδο δίνοντας έτσι τη δυνατότητα κατανόησης της λειτουργικής ποικιλομορφίας που υπάρχει σε πρωτεϊνικές οικογένειες των polydna ιών. Τα αποτελέσματα είναι συμβατά με την υπόθεση ότι οι πρωτεΐνες επαναλήψεων αγκυρίνης των polydna ιών δρουν ως αναστολείς παραγόντων Rel/NF-κΒ, τόσο στα λεπιδόπτερα έντομα όσο και στα θηλαστικά. Μάλιστα, στα έντομα, οι πρωτεΐνες Ank έχουν τη δυνατότητα να καταστέλλουν και τις δύο κύριες ανοσολογικές οδούς μεταγωγής σήματος, Toll και Imd. Επίσης, φαίνεται ότι τα μέλη της οικογένειας Ank του ενδοσυμβιωτικού ιού ενός Υμενοπτέρου που παρασιτεί ένα συγκεκριμένο Λεπιδόπτερο μπορούν να παρεμποδίζουν τη λειτουργία ρυθμιστών της ανοσίας και άλλων Λεπιδοπτέρων πέραν του φυσικού του ξενιστή. Επομένως, πρωτεΐνες των polydna ιών, όπως οι Ank, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την καταστολή του ανοσοποιητικού συστήματος των εντόμων στα πλαίσια ενίσχυσης ήδη υπάρχοντων στρατηγικών καταπολέμησης επιβλαβών εντόμων, οι οποίες βασίζονται στη χρήση εντομοπαθογόνων μικροοργανισμών.