Επιγενετικός έλεγχος της δημιουργίας και της διατήρησης της ταυτότητας ενός νευρικού βλαστικού κυττάρου

Abstract

A central issue in the tissue regeneration field lies in the generation of large populations of pluripotent and multipotent cell populations. The formation and differentiation of pluripotent cells is important for mammalian development. During early mouse development, pluripotent cells exist in the naïve epiblast (primitive ectoderm) in waiting to get primed for the generation of the three germ layers during gastrulation. The importance of mouse Embryonic Stem Cell (ESC)-derived Primitive Ectoderm like cells (EPL) and Epiblast Stem Cells (EpiSCs) lies with the discovery that they could resemble human ESCs. However, the mechanism of primitive ectoderm induction and maintenance is still unclear. Here, we present a SOX2-instructed conversion of ESC to large numbers of primitive ectoderm bodies (Epispheres) by lineage selection. The ESC to Epispheres transition is accompanied by down-regulation of Οct4 and the up-regulation of Fgf5 and Nanog involved in primitive ectoderm formation. Although, Epispheres express Nodal and low levels of T and Wnt3a, they do not express any other early mesodermal genes such as Cer1, Gscl, Meox1 and Ttr, but yet they retain their ability to respond to BMP4, an extrinsic signal guiding the formation of mesendodermal derivatives. In the absence of of early endodermal gene expression, Afp, Foxa1 and Foxa2, Epispheres appear to maintain the ability to respond to extrinsic signals such as Activin-A guiding the formation of endodermal derivatives. Consistent with the ectodermal character acquired over time, depicted by the induction of neuroectodermal genes Nestin and Pax6, respond to all-trans retinoic acid to generate RC2-positive radial glia cells that in turn differentiate into neurons, glia and oligodendrocytes. Once injected to kidney capsules of immunocompromised RAG-/- mice, Epispheres fail to generate tumours when compared to the parental ESC line. Lastly, Epispheres respond to LIF and revert into an ESC state, maintain their phenotype for successive passages in culture and regain their ability to generate tumours in RAG-/- mice. Thus, Epispheres provide for a novel, safe and efficient study model for the exploitation of early development and biomedical applications.

Κατά τη διάρκεια των αρχικών σταδίων της ανάπτυξης του ποντικού, πλειοδύναμα κύτταρα εντοπίζονται στην προεμφυτευτική, πρώϊμη επιβλάστη, αναμένοντας μετεμφυτευτικά (όψιμη επιβλάστη-πρωτογενές εξώδερμα) την ενεργοποίησή τους από σηματοδοτικά μόρια, για να δώσουν τα τρία βλαστικά δέρματα κατά τη διάρκεια της γαστριδίωσης. H σημασία της in vitro δημιουργίας κυττάρων που προσομοιάζουν με την επιβλάστη από εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα ποντικού και της απομόνωσης και καλλιέργειας κυττάρων της μετεμφυτευτικής επιβλάστης έγκειται στη διαπίστωση πως τα κύτταρα αυτά παρουσιάζουν ομοιότητες με τα ανθρώπινα εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα. Οι μηχανισμοί δημιουργίας της όψιμης, ενεργοποιημένης επιβλάστης, όμως, δεν είναι γνωστοί. Το γονίδιο Sox2 κωδικοποιεί για ένα μεταγραφικό παράγοντα που περιέχει την περιοχή HMG-box, ο οποίος είναι απαραίτητος για την πλειοδυναμία των εμβρυονικών βλαστικών κυττάρων και για τη δημιουργία της επιβλάστης. Κατά την πρώϊμη ανάπτυξη, το γονίδιο Sox2 εκφράζεται στο μορίδιο, την εσωτερική κυτταρική μάζα της βλαστοκύστης και αργότερα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης εκφράζεται στις αισθητικές πλάκες, το αρχέντερο και το νευρικό σύστημα. Τα έμβρυα, στα οποία έχει απαλειφεί το γονίδιο Sox2, πεθαίνουν στο στάδιο της εμφύτευσης απουσία επιβλάστη, αποδεικνύνοντας πως το Sox2 είναι αναγκαίο για τη δημιουργία της επιβλάστης in vivo. Σε αυτήν την εργασία, χρησιμοποιώντας εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα που μας επιτρέπουν να ελέγχουμε τη συνεχή έκφραση του γονιδίου Sox2, δημιουργήσαμε κύτταρα πρωτογενούς εξωδέρματος, τα ΚΠΕ, με χαρακτήρα ενεργοποιημένης - όψιμης επιβλάστης, αποδεικνύοντας πως η συνεχής έκφραση του Sox2 είναι ικανή να δημιουργήσει επιβλάστη απο εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα in vitro. Η μετάβαση αυτή συνοδεύεται, σε συμφωνία και με ό,τι έχει παρατηρηθεί μέχρι τώρα σε άλλες εργασίες,απο την ισχυρή παρουσία των μεταγραφικών επιπέδων του γονιδίου Οct4 και την αύξηση των επιπέδων του Nanog, δύο γονιδίων που κωδικοποιούν για παράγοντες πλειοδυναμίας,καθώς και από την ομοιόμορφη και ισχυρή παρουσία των πρωτεϊνικών μορίων που αυτά κωδικοποιούν. Ταυτόχρονα, παρατηρείται άνοδος των μεταγραφικών επιπέδων των γονιδίων Fgf5 και Nodal, φαινόμενο το οποίο συνδέεται στενά με τη δημιουργία της επιβλάστης. Ο κυτταρικός πληθυσμός των ΚΠΕ παρουσιάζει ίχνη μεταγραφικών επιπέδων των γονιδίων του μεταγραφικού παράγοντα Τ και του σηματοδοτικού μορίου Wnt3a, μόρια υπεύθυνα για τη δημιουργία του οπίσθιου άκρου της επιβλάστης, που θα δώσει το μεσόδερμα κατά τη γαστριδίωση. Τα ΚΠΕ δεν εκφράζουν άλλα μεσοδερμικά γονίδια, όπως τα Cer, Gscl, Meox1 και Ttr. Παρόλα αυτά, διατηρούν την ικανότητά τους να διαφοροποιούνται ομοιογενώς σε διαφοροποιημένα κύτταρα μεσοδερμικής προέλευσης, και συγκεκριμένα σε κοινούς προδρόμους των ενδοθηλιακών και αιμοποιητικών κυττάρων, αποκρινόμενα στη δράση του σηματοδοτικού μορίου BMP4. Ακόμα, η απουσία των πρώϊμων ενδοδερμικών παραγόντων AFP, Foxa1 και Foxa2 στα ΚΠΕ δεν εμποδίζει τη δυνατότητά τους να διαφοροποιούνται σε κύτταρα μεσενεδοδερμικής προέλευσης, που εκφράζουν τον ηπατικό παράγοντα FOXA2, κάτω από την επίδραση του σηματοδοτικού μορίου Α-activin. Σε πλήρη συμφωνία με τον εξωδερμικό χαρακτήρα των κυττάρων πρωτογενούς εξωδέρματος, τα ΚΠΕ εκφράζουν εξωδερμικά γονίδια, όπως η Nestin και η NeuroD και διαφοροποιούνται κάτω από την επίδραση του ρετινοϊκού οξέος σε νευρώνες και ολιγοδενδροκύτταρα. Η πλαστικότητα που επιδεικνύουν τα ΚΠΕ δε συνοδεύεται από την ικανότητα γένεσης τερατωμάτων, χαρακτηριστική ιδιότητα των πλειοδύναμων κυττάρων, όπως είναι τα εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα και οι κυτταρικές σειρές που απομονώνονται από τη μετεμφυτευτική επιβλάστη. Αυτό αποδίδεται στο ότι έχουν ενεργοποιηθεί από άγνωστα μέχρι στιγμής σηματοδοτικά μόρια, με αποτέλεσμα να έχουν απωλέσει μέρος του αναπτυξιακού δυναμικού της πλειοδύναμης πρώϊμης επιβλάστης. Επιπλέον,τα ΚΠΕ έχουν τη δυνατότητα να μεταπίπτουν σε ΕΒΚ,όταν καλλιεργηθούν υπό συνθήκες ανάλογες, κάτι το οποίο είναι χαρακτηριστικό των κυττάρων πρωτογενούς εξωδέρματος. Συνοψίζοντας, από την παρούσα εργασία δημιουργήθηκαν αρχέγονα κύτταρα που αντιπροσωπεύουν την ενεργοποιημένη πλειοδύναμη κατάσταση της επιβλάστης και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την μελέτη των αρχικών σταδίων της ανάπτυξης και για βιοιατρικές εφαρμογές.