Investigation of molecular parameters on cartilage regeneration in experimental models of cartilage defects and osteoarthritis

Abstract

Articular cartilage and fibrocartilage have limited abilities to self-repair following disease- or injury-induced degradation. Given the critical role of these tissues to protect the osseous features of the knee and other joints in the human body, and ensure smooth, stable joint articulation, it is necessary to develop treatments that promote regeneration and/or repair of these tissues. Tissue engineering holds tremendous potential as a future means to treat damaged or diseased cartilaginous tissues. While much progress has been recently made toward developing functional neocartilage constructs with compressive properties on par with native tissue values, their tensile properties remain far behind. It is, therefore, critical that novel treatments be established to generate robust neotissue to address the approximately 46.4 million individuals affected by arthritis in the United States alone.Motivated by the progress that has been achieved in cartilage tissue engineering the past decade, this thesis had three global objectives: 1) to investigate novel molecular pathways toward regenerating articular cartilage in in vitro and in vivo experimental models of cartilage defects and osteoarthritis, 2) to develop and optimize treatment modalities toward engineering neocartilage of clinical applicability, and 3) to promote neotissue maturation and foster integration between self-assembled neocartilage and native tissue. Toward achieving these goals, this thesis sought to tailor the use of exogenous agents to promote native articular cartilage and fibrocartilage organization in engineered tissues. To begin, a treatment regimen consisting of copper and hydroxylysine, two important mediators of the physiologic collagen crosslinking process, was utilized to enhance the collagen crosslink content of self-assembled neocartilage constructs. A hypoxia treatment regimen was also investigated with the similar goal of enhancing the crosslink content and, therefore, the functional properties of native and engineered musculoskeletal tissues. Given the well-described correlation between increased collagen crosslink content and neotissue tensile properties, a more direct approach to increase these crosslinks was established via application of the exogenous agent lysyl oxidase (LOX) to further enhance neotissue functional properties. Other studies in this thesis focused on developing approaches for enhancing the collagen content and organization of the engineered tissues that, when combined with the novel collagen crosslinking approaches, would potentially result in mature engineered tissues capable of repairing cartilage defects in experimental (animal) models. Specifically, two agents known to modulate intracellular Ca2+ signaling (digoxin and adenosine triphosphate) were investigated as an alternative means to improve matrix content and biomechanical properties of neocartilage through promoting both collagen enhancement and collagen crosslinking. In addition, similar studies were focused on optimizing a treatment regimen consisting of the biophysical agent chondroitinase-ABC (C-ABC) and the biochemical agent transforming growth factor-β1 (TGF-β1) to enhance the functional properties of self-assembled neofibrocartilage constructs. Biomechanical stimulation in the form of passive axial compressive loading was also examined to aid in further driving in vitro development of self-assembled neofibrocartilage in an organized, shape-specific manner. An additional study investigated the possibility of alternative primary cell sources from the ankle joint as a superior cell source for generating tissue-specific self-assembled neocartilage for ankle joint cartilage defects.Finally, this thesis investigated the potential of the exogenously applied LOX molecular mechanism to promote integration between neocartilage and native tissue. An initial study investigated the ability of LOX to promote integration between neocartilage and native articular cartilage. Promising results lead to combining LOX with C-ABC and TGF-β1 with the goal of inducing simultaneous neofibrocartilage maturation and integration. Specifically, this novel combination of stimuli was first applied to an in vitro model of integration, and then on an experimental animal model of integration to investigate the ability of the in vivo environment to further promote such integration. Overall, the series of studies presented in this thesis represent various novel and potentially clinically significant molecular strategies to enhance the functional properties of a spectrum of collagen-rich tissues. Specifically, copper, endogenous LOX enhancement though hypoxia, and exogenous LOX application were all found to improve the mechanical properties of engineered cartilage, demonstrating the ability of enhancing collagen crosslinks to promote the development of mechanically robust, biomimetic neotissues. Further, agents such as digoxin, adenosine triphosphate, C-ABC, TGF-β1, and static weight application were all found to exhibit significant abilities toward promoting collagen enhancement and collagen crosslinking in neotissues. Finally, exogenous LOX applied alone and in combination with C-ABC and TGF-β1 was found to foster in vitro and in vivo tissue maturation and integration, illustrating the promise of this novel combination of agents to promote in vivo tissue regeneration. Taken together, these studies provide an overview of several exciting and promising technologies to 1) increase the functional properties of both native and engineered tissues, and 2) to enhance their ability to integrate in vivo, highlighting the tremendous potential of such agents toward developing clinically robust neotissues to repair and/or replace those damaged by injury or disease.

Ο αρθρικός και ο ινώδης χόνδρος έχουν περιορισμένη ικανότητα αναγέννησης μετά από τραυματικές κακώσεις και παθήσεις των αρθρώσεων. Δεδομένου του κριτικού ρόλου των ιστών αυτών στην προστασία των αρθρικών οστικών δομών και στην εξασφάλιση σταθερών λειτουργικών αρθρώσεων, η ανάπτυξη μεθόδων που προάγουν την αναγέννηση ή / και την επιδιορθώση των ιστών αυτών ειναι εξαιρετικά σημαντική. Η επιστήμη της ανάπτυξης μηχανικών ιστών παρέχει σήμερα εξαιρετικές προοπτικές στη θεραπεία των εκφυλισμένων και παθολογικών χόνδρινων ιστών. Και ενώ μεγάλη πρόοδος έχει επιτευχθεί πρόσφατα ως προς την ανάπτυξη νεοχόνδρινων ιστών με θλιπτικές μηχανικές ιδιότητες ανάλογες των φυσικών ιστών, ωστόσο οι ιδιότητες εφελκυσμού των νεοϊστών ειναι συγκριτικά υποδιαίστερες. Ως εκ τούτου, η ανάγκη ανάπτυξης νέων βελτιωμένων μεθόδων για να δημιουργία λειτουργικών νεοϊστών και την αποτελεσματική αντιμετώπιση των περίπου 46.4 εκατομμυρίων ασθένών που υποφέρουν σήμερα από αρθρίτιδα μόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες, καθίσταται ιδιαίτερα επιτακτική.Δεδομένης της προόδου που έχει επιτευχθεί την τελευταία δεκαετία στην ανάπτυξη μηχανικών χόνδρινων ιστών, η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει τρεις γενικούς στόχους: 1) τη διερεύνηση νέων μοριακών/βιολογικών μεθόδων αναγέννησης του αρθρικού χόνδρου σε in vitro και in vivo πειραματικά μοντέλα χόνδρινων βλαβών και οστεοαρθρίτιδας, 2) την ανάπτυξη ή/και βελτίωση μεθόδων αναγέννησης νεοχόνδρινών ιστών με ευρεία κλινική εφαρμογή, και 3) την ανάπτυξη μεθόδων βιολογικής και μηχανικής ωρίμανσης των νεοϊστών και μεθόδων ενσωμάτωσης τους με το φυσικό ιστό μετά απο μεταμόσχευση. Για την επίτευξη των στόχων αυτών, η παρούσα διατριβή περιγράφει την διερεύνηση νέων εξωγενών βιολογικών παραγόντων για την ανάπτυξη μηχανικών νεοϊστών με δομική οργάνωση ανάλογης των αντίστοιχων φυσικών ιστών. Αρχικά, μελετήθηκε η χρήση του χαλκού και της υδροξυλυσίνης, δύο σημαντικών μεσολαβητών της φυσιολογικής διαδικασίας ανάπτυξης διασταυρώμενων δέσμών κολλαγόνου, για την ενίσχυση της περιεκτικότητας των διασταυρώμενων δεσμών κολλαγόνου στους μηχανικούς ιστούς. Αναλόγως, σε μια διαφορετική μελέτη διερευνήθηκε η in vitro καλλιέργεια φυσικών μυοσκελετικών ιστών και μηχανικών νεοϊστών σε υποξικό περιβάλλον, με στόχο την ενίσχυση της περιεκτικότητάς τους σε διασταυρώμενους δεσμούς κολλαγόνου, και ως εκ τούτου, τη βελτίωση των λειτουργικών τους ιδιοτήτων. Λαμβάνοντας υπόψη την εκταινώς περιγεγραμένη στη βιβλιογραφία θετική συσχέτιση μεταξύ της περιεκτικότητας διασταυρούμενων δεσμών κολλαγόνου και εφελκυστικών μηχανικών ιδιοτήτων των νεοϊστών, μελετήθηκε μία νέα μέθοδος για την αύξηση αυτών των διασταυρούμενων δεσμών κολλαγόνου βασιζόμενη στην εξωγενή χορήγηση του ενζύμου λυσυλική οξειδάση (LOX) κατά τη καλλιέργεια των νεοϊστών, με απώτερο στόχο την περαιτέρω ενισχυση των λειτουργικών τους ιδιοτήτων.Άλλες μελέτες της παρούσας διατριβής επικεντρώνονται στην ανάπτυξη μεθόδων ενίσχυσης της περιεκτικότητας των μηχανικών ιστών σε κολλαγόνο, που όταν συνδυάζονται με τις τεχνικές ενίσχυσης των διασταυρούμενων δεσμών κολλαγόνου θα μπορούσαν να βελτιώσουν περαιτερώ την μηχανική ωρίμανση των νεοϊστών για την αποτελεσματική αποκατάσταση χόνδρινών ελλειμάτων σε πειραματικά μοντέλα αρθρικών παθήσεων. Ειδικότερα, δύο παράγοντες που είναι γνωστοί ρυθμιστές της ενδοκυτταρικής σηματοδότησης του Ca2+ (η διγοξίνη και η τριφωσφορική αδενοσίνη), εξετάστηκαν ως εναλλακτικές μέθοδοι για τη μηχανική βελτίωση των ιστών μέσω αύξησης της περιεκτικότητάς τους σε κολλαγόνο και σε διασταυρούμενους δεσμούς κολλαγόνου. Επιπλέον, ανάλογες μελέτες επικεντρώθηκαν στην βελτίωση μιας θεραπευτικής αγωγής που περιλαμβάνει το βιοφυσικό παράγοντα χονδροϊτινάση-ABC (C-ABC) και τον βιοχημικό παράγοντα αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού -β1 (ΤGF-β1) με στόχο πάλι την ενισχύση τών λειτουργικών ιδιοτήτων των νεοχόνδρινων ιστών. Μια διαφορετική μελέτη εξέτασε την ικανότητα της εμβιομηχανικής διέγερσης με τη μορφή παθητικής αξονικής θλιπτικής φόρτισης να συμβάλλει σε in vitro ανάπτυξη νεοχόνδρινών ιστών με προδιαγεγραμμένο σχήμα/αρχιτεκτονική. Τέλος, μια πρόσθετη μελέτη διερεύνησε την χρήση χονδροκυττάρων απο την ποδοκνημική άρθρωση για την κατασκευή νεοχόνδρινων μοσχευμάτων προοριζόμενων για την βλάβες της ποδοκνημικής άρθρωσης.Καταλεικτικά, η παρούσα διατριβή διερεύνησε τη δυνατότητα ενσωμάτωσης του νεοχόνδρινου με τον φυσικό ιστό μέσω της εξωγενούς χορήγησης του ενζύμου LOX. Μια αρχική μελέτη διερεύνησε τη δυνατότητα του LOX να προώθηση της ενσωμάτωσης μεταξύ του νεοχόνδρου και του φυσικού αρθρικού χόνδρου σε in vitro περιβάλλον καλλιέργειας των ιστών. Ελπιδοφόρα αποτελέσματα αυτής της μέλετης οδήγησαν σε συνδυασμό του ενζύμου LOX με τους παράγοντες C-ABC και ΤGF-β1 με στόχο την ταυτόχρονη ενίσχυση της ωρίμανσης του νεοχόνδρου και τη ενσωμάτωση του με τον φυσικό αρθρικό χόνδρο. Ειδικότερα, ο συνδυασμός των παραγόντων αυτών εφαρμόστηκε πρώτα σε ένα in vitro μοντέλο ενσωμάτωσης των δύο ιστών, και στη συνέχεια σε ένα πειραματικό ζωικό μοντέλο για τη διερεύνηση της ικανότητας του in νίνο περιβάλλοντος να ενισχύσει περαιτέρω της βιολογική αυτή διεργασία.Σε γενικές γραμμές, η σειρά των μελετών που περιγράφονται στην παρούσα διατριβή αντιπροσωπεύουν πρωτοπόρες και δυνητικώς κλινικά εφαρμόσιμες μοριακές μεθόδους για την ενίσχυση των λειτουργικών ιδιοτήτων ενός μεγάλου φάσματος κολλαγόνων ιστών και νεοϊστών. Συγκεκριμένα, ο χαλκός, η ενδογενής παραγώγη του ενζύμου LOX μέσω της καλλιεργειας των ιστών σε υποξίκό περιβάλλον, και η εξωγενή χορήγηση του LOX βελτιώνουν τις μηχανικές ιδιότητες των μηχανικών ιστών αναδεικνύοντας την ικανότητα στόχευσης της αύξησης των διαστραυρούμενων δεσμών κολλαγόνου για την ανάπτυξη βιομιμητικών και μηχανικά ισχυρών νεοχονδρινών ιστών. Εναλλακτικά, η διγοξίνη, η τριφωσφορική αδενοσίνη, ο C-ABC, ο ΤGF -β1, και η στατική εφαρμογή βάρους αποτελουν αποτελεσματικές μεθόδους για την ενίσχυση του κολλαγόνου και την αυξηση των διαστραυρούμενων δεσμών κολλαγόνου στους νεοϊστούς. Τέλος, η εξωγενής χορήγηση του LOX, μονομερώς ή σε συνδυασμό με τους παράγοντες C-ABC και ΤGF -β1, βρέθηκε να προάγει την in vitro και in vivo ωρίμανση των νεοϊστών και την ενσωμάτωση τους με το φυσικό ιστό, αντανακλώντας την πολλά υπόσχόμενη συνδιαστική χρήση των παραγόντων αυτών για την θεραπευτική αντιμετώπιση χόνδρινων βλαβών in νίνο. Συνολικά, οι μελέτες που περιγράφονται στην παρούσα διατριβή αποτελούν μια επισκόπηση διαφορετικών και πολλά υποσχόμενων νέων τεχνολογιών με στόχο 1) την ενίσχυση των μηχανικών ιδιοτήτων των φυσικών ιστών και νεοϊστών, και 2) την ενίσχυση των δυνατοτήτων τους να ενσωματώνονται in vitro, υπογραμμίζοντας τη δυνατότητα για εφαρμογή των τεχνολογιών αυτών στη ανάπτυξη κλινικά λειτουργικών νεοϊστών για την επιδιόρθωση και / ή αντικατάσταση των ιστών που έχουν καταστραφεί από τραυματισμό ή ασθένεια.