Η πρωτεάση των χλωροπλαστών και ο ρόλος της στην αποδόμηση της LHCII αποπρωτεΐνης

Abstract

In the current PhD thesis the nature of plastidic LHCII (Light Harvesting Complex serving PSII) protease and its role in biogenesis and photosynthetic membrane function was studied. The study was conducted by using mainly biochemical and also molecular biology techniques (isolation, separation and characterization of macromolecules (proteins/DNA)).It was found that intact etioplasts of bean (Phaseolus vulgaris) plants exhibit proteolytic activity against the exogenously added apoprotein of the light-harvesting pigment-protein complex serving photosystem II that increases as etiolation is prolonged. The activity increases in the membrane fraction but not in the stroma, where it remains low and constant and is mainly directed against LHCII and protochlorophyllide oxidoreductase. The thylakoid proteolytic activity, which is low in etioplasts of 6-d-old etiolated plants, increases in plants pretreated with a pulse of light or exposed to intermittent-light (ImL) cycles, but decreases during prolonged exposure to continuous light, coincident with chlorophyll (Chl) accumulation. To distinguish between the control of Chl and/or development on proteolytic activity, we used plants exposed to ImL cycles of varying dark-phase durations. In ImL plants exposed to an equal number of ImL cycles with short or long dark intervals (i.e. equal Chl accumulation but different developmental stage) proteolytic activity increased with the duration of the dark phase. In plants exposed to ImL for equal durations to such light-dark cycles (i.e. different Chl accumulation but same developmental stage) the proteolytic activity was similar. These results suggest that the protease, which is free to act under limited Chl accumulation, is dependent on the developmental stage of the chloroplast, and give a clue as to why plants in ImL with short dark intervals contain LHCII, whereas those with long dark intervals possess only photosystem-unit cores and lack LHCII.The effect of Cd on chlorophyll (Chl) as well as on LHCII accumulation has also been examined during the early stages of development in etiolated Phaseolus vulgaris leaves exposed to intermittent light-dark cycles. We found that at the Cd concentrations studied, both Chl and LHCII accumulation were drastically reduced, although the lithium dodecyl sulphate-solubilized total leaf protein level remained unaffected. However, on the basis of total chlorophyll present, the amount of stabilized LHCII was similar in both Cd-treated and nontreated samples. Additionally, the thylakoid-bound protease known to degrade LHCII was found to be inhibited by Cd treatment both in vivo and in vitro. Finally, Northern hybridization analysis indicated that Cd affects LHCII accumulation by reducing drastically the steady-state level of Lhcb transcripts.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η φύση της πρωτεάσης της LHCII (Light Harvesting Complex) αποπρωτεΐνης των χλωροπλαστών από φύλλα φασολιού (Phaseolus vulgaris) και ο ρυθμιστικός της ρόλος τόσο στην βιογένεση όσο και στην λειτουργία της φωτοσυνθετικής μεμβράνης. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε με χρήση κυρίως βιοχημικών, αλλά και τεχνικών μοριακής βιολογίας (απομόνωση, διαχωρισμός και χαρακτηρισμός μακρομορίων (πρωτεϊνών/DNA)).Βρέθηκε ότι άθικτοι ωχροπλάστες φασολιού παρουσιάζουν πρωτεολυτική ενεργότητα ως προς εξωγενώς προστιθέμενη LHCII αποπρωτείνη, που αυξάνει παράλληλα με την ανάπτυξη του φυτού. Η ενεργότητα αυξάνει στο μεμβρανικό κλάσμα και όχι στο στρώμα, όπου εκεί παραμένει χαμηλή και σταθερή. Επομένως, η αύξηση που παρατηρούμε δεν οφείλεται σε μεταβαλλόμενη πρόσδεση της πρωτεάσης στα προθυλακοειδή κατά την ανάπτυξη, αλλά πιθανότατα αντικατοπτρίζει την de novo σύνθεση του πρωτεολυτικού συστήματος. H πρωτεολυτική ενεργότητα των θυλακοειδών είναι χαμηλή σε ωχροπλάστες ηλικίας 6-ημερών και αυξάνει σε φυτά που εκθέτονται σε μια αναλαμπή φωτός ή σε κύκλους περιοδικού φωτισμού, αλλά μειώνεται μετά από παρατεταμένη έκθεση σε συνεχή φωτισμό, παράλληλα με την συσσώρευση της χλωροφύλλης. Το φαινόμενο όμως αυτό εξαλείφεται όταν τα θυλακοειδή διαλυτοποιηθούν σε ΤΧ-100. Αντίθετα, η διαλυτοποίηση σε TX-100 των προθυλακοειδών και των πρωτογενών θυλακοειδών δεν επιδρά στην πρωτεολυτική τους ενεργότητα ως προς εξωγενή LHCII αποπρωτεΐνη. Επιπλέον, η προσθήκη ΤΧ-100 διαλυτοποιημένων ώριμων θυλακοειδών (πλούσιων σε χλωροφύλλη) σε αδιάλυτα πρωτογενή θυλακοειδή δεν έχει καμία επίδραση στην πρωτεολυτική ενεργότητα των δεύτερων. Συμπεραίνουμε επομένως, ότι η μείωση της ενεργότητας στα θυλακοειδή φυτών που εκθέτονται στον συνεχή φωτισμό, οφείλεται σε παρεμπόδιση της πρωτεολυτικής δράσης λόγω οργάνωσης του υποστρώματος και όχι λόγω αναστολής της πρωτεολυτικής δράσης από την χλωροφύλλη. Επομένως, ο σχηματισμός χλωροφυλλοπρωτεϊνικού συμπλόκου προστατεύει την LHCII αποπρωτεΐνη από την πρωτεάση.Βρέθηκε επίσης ότι φυτά που εκθέτονται σε περιοδικό φωτισμό και δέχονται τον ίδιο αριθμό αναλαμπών, έχοντας όμως διαφορετική διάρκεια σκοτόφασης (ίδια συσσώρευση χλωροφύλλης, διαφορετικό στάδιο ανάπτυξης), παρουσιάζουν μεγαλύτερη ενεργότητα όσο μεγαλώνει η διάρκεια της σκοτόφασης (περισσότερο αναπτυγμένα). Φυτά που βρίσκονται στην ίδια αναπτυξιακή κατάσταση αλλά έχουν συσσωρεύσει διαφορετικά ποσά χλωροφύλλης έχουν την ίδια περίπου πρωτεολυτική ενεργότητα. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η πρωτεάση, η οποία μπορεί και δρα σε συνθήκες περιορισμένης συσσώρευσης χλωροφύλλης και εξαρτάται από το στάδιο ανάπτυξης του φυτού, παίζει καθοριστικό ρόλο στην σταθεροποίηση της LHCII αποπρωτεΐνης. Επίσης μελετήθηκε η επίδραση του Cd2+ στην συσσώρευση χλωροφύλλης και στην σταθεροποίηση της LHCII αποπρωτεΐνης κατά την ανάπτυξη των φυτών σε περιοδικό φωτισμό. Βρέθηκε ότι χορήγηση in vivo διαλυμάτων Cd2+ σε φυτά που αναπτύσσονται σε συνθήκες περιοδικού φωτισμού προκαλεί μείωση της ποσότητας LHCII που σταθεροποιείται στα πρωτογενή θυλακοειδή. Στις συνθήκες αυτές η συσσώρευση Chl μειώνεται, η ικανότητα πρωτεϊνικής σύνθεσης δεν επηρεάζεται, ενώ ο λόγος σταθεροποιημένης LHCII/Chl παραμένει σταθερός. Επιπλέον, η πρωτεολυτική ενεργότητα που αποδομεί την LHCII αποπρωτεΐνης των πρωτογενών θυλακοειδών αναστέλλεται παρουσία Cd2+ τόσο in vivo όσο και in vitro. Τέλος, βρέθηκε ότι η επίδραση της χορήγησης Cd2+ εκδηλώνεται στο μεταγραφικό στάδιο, προκαλώντας την μείωση του αριθμού των μεταγραφημάτων της LHCII.