Ρύθμιση της μετα-μεταφραστικής τροποποίησης και σταθερότητας bHLH μεταγραφικών παραγόντων μέσω αλληλεπιδράσεων μεταξύ τους

Abstract

In neural fate assignment throughout the animal kingdom, three classes of bHLH transcription factors play crucial roles. Class II bHLH activators [such as Scute (Sc) in Drosophila] heterodimerize with a class I bHLH protein [Daughterless (Da)] and promote neural fate; they are therefore called proneural proteins. Neural fate is suppressed by transcriptional repressors that belong to class VI bHLH-Orange proteins [such as Enhancer of split, E(spl)]. Previous work, both from our lab and others, has shown that E(spl) and proneural proteins antagonize each other by various mechanisms, that include transcriptional regulation of the same target genes, either through binding to different DNA binding sites within the same cis-regulatory modules or/and by recruitment of E(spl) to proneural target genes via interaction with the Da/Sc complex. In this study we examined cis elements of the Scute protein that affect its stability and function when the protein is expressed without or with its partner, Da. We found that Sc is a labile phosphorylated protein and has two types of degradation signals (degrons I, II) depending on its dimerization status; both degrons lead Scute to proteasome. In the absence of Da, the major Sc degron (degron I) is its transcriptional activation domain (TAD), which can promote degradation off DNA and does not require Sc phosphorylation. The second degron (type II) is activated when Sc is heterodimerized with Da, while at the same time degron I is inactivated. Degron II is a composite degron and has three prerequisites. The Da/Sc heterodimer must be able to bind DNA, the two Da TADs must be present and Sc must be phosporylated on its major phosphorylation motif, S²⁶⁸PTS. Despite the fact that half of these elements belong to the Da partner (the two TADs and half of the basic DNA binding domain), Da itself is a very stable protein. In parallel to the above analysis we found a new way of antagonism between proneural proteins and E(spl) proteins, which is mutual protein degradation upon interaction. By using different mutant forms of the proteins we conclude that the two events (Da/Sc degradation by E(spl) vs E(spl) degradation by Da/Sc) use two different mechanisms that have similarities and differences. In both types of degradation the proteins must be able to interact with each other and E(spl)m7 DNA binding is dispensable. Degradation of E(spl)m7 by the Da/Sc complex is favoured if Da/Sc is able to bind onto DNA. Degradation of Da/Sc complex by E(spl)m7 does not need DNA binding of either transcription factor, but depends on recruitment of the corepressor Groucho. Additionally Scute has to be phosphorylated on the S²⁶⁸PTS motif in order to be degraded by m7. These results indicate that the Da/Sc/m7 complex recruits different degradation factors (e.g. E3 ligases) that specifically target the different components of the complex. An intriguing observation in the process of these studies is that Da induces a significant increase in the MW of both Sc and E(spl)m7 upon complex formation. This effect can be mimicked by proteasome inhibition suggesting that this modified fraction of Sc or m7 is rather unstable. Although both Sc and E(spl)m7 display mono- and poly- ubiquitylation, as well as other high MW modifications, we have no conclusive evidence regarding the molecular nature of the Da-induced MW shift.

Κατά τον καθορισμό της νευρικής τύχης, σε όλο το βασίλειο των μεταζώων, τρεις κατηγορίες μεταγραφικών παραγόντων τύπου bHLH έχουν καθοριστικό ρόλο. Οι bHLH μεταγραφικοί ενεργοποιητές, τάξης ΙΙ, [όπως το Scute (Sc) στην Drosophila] ετεροδιμερίζονται με την πανταχού εκφραζόμενη τάξης Ι, bHLH πρωτεΐνη [Daughterless (Da)], και προωθούν την νευρική τύχη - για αυτό καλούνται προνευρικές πρωτεΐνες. Η νευρική τύχη καταστέλλεται από τους μεταγραφικούς καταστολείς της κατηγορίας bHLH-Orange πρωτεϊνών [όπως οι πρωτεΐνες Enhancer of split, E(spl)] (τάξη VI). Προηγούμενες μελέτες από το δικό μας εργαστήριο και από άλλα, έχουν δείξει ότι οι πρωτεΐνες E(spl) και οι προνευρικές πρωτεΐνες αλληλοανταγωνίζονται την δράση με ποικίλους τρόπους. Οι τρόποι αυτοί περιλαμβάνουν την μεταγραφική ρύθμιση των ίδιων γονιδίων στόχων, είτε με άμεση πρόσδεση των πρωτεϊνών σε διαφορετικές θέσεις-στόχους ίδιες μέσα στους ίδιους ενισχυτές ή και με στρατολόγηση των πρωτεϊνών E(spl) σε γονίδια στόχους των προνευρικών πρωτεΐνών, μέσω αλληλεπιδράσεων με το σύμπλοκο Da/Sc. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε στοιχεία cis της πρωτεΐνης Sc τα οποία επηρεάζουν τη σταθερότητα και τη δράση της πρωτεΐνης όταν αυτή εκφράζεται μόνη της ή μαζί με τον παρτενέρ της Da. Βρήκαμε ότι η πρωτεΐνη Sc είναι μια ασταθής φωσφοπρωτεΐνη, η οποία διαθέτει δύο τύπους αποικοδομητικών σινιάλων (degrons I, II) ανάλογα με την κατάσταση διμερισμού που βρίσκεται. Και τα δύο αποικοδομητικά σινιάλα οδηγούν την πρωτεΐνη στο πρωτεάσωμα. Απουσία Da, το κύριο αποικοδομητικό σινιάλο (degron I) είναι η περιοχή ενεργοποίησης της μεταγραφής της πρωτεΐνης (TAD), η δράση του οποίου δεν εξαρτάται από την πρόσδεση του Sc στο DNA, αλλά ούτε από την φωσφορυλίωση του Sc. Το δεύτερο σινιάλο αποικοδόμησης (type II) ενεργοποιείται όταν το Sc ετεροδιμερίζεται με το Da, ενώ την ίδια στιγμή απενεργοποιείται το degron I. Το degron ΙΙ είναι σύνθετο και πρέπει να πληρούνται τρεις προϋποθέσεις για να λειτουργήσει. Το ετεροδιμερές Da/Sc πρέπει να είναι ικανό να προσδεθεί στο DNA, χρειάζονται τα δύο TADs του Da, καθώς επίσης και το Sc να είναι φωσφορυλιωμένο στην κύρια θέση φωσφορυλίωσής του, S²⁶⁸PTS. Παρά το γεγονός ότι τα μισά στοιχεία ανήκουν στην πρωτεΐνη Da (τα δύο TADs και η μισή περιοχή πρόσδεσης στο DNA), το Da καθαυτό είναι πολύ σταθερή πρωτεΐνη. Παράλληλα με την παραπάνω ανάλυση βρήκαμε έναν νέο μηχανισμό ανταγωνισμού μεταξύ των προνευρικών και των E(spl) πρωτεϊνών, που είναι η αμοιβαία αλληλοκαταστροφή τους μέσω αλληλεπίδρασης. Με την χρήση διαφορετικών μεταλλαγμένων μορφών των παραπάνω πρωτεϊνών συμπεράναμε ότι οι δύο καταστροφές [καταστροφή του συμπλόκου Da/Sc από τις E(spl) και καταστροφή των E(spl) από τις Da/Sc) χρησιμοποιούν διαφορετικούς μηχανισμούς που έχουν κάποιες ομοιότητες αλλά και διαφορές. Και στους δύο τύπους καταστροφών οι πρωτεΐνες πρέπει να είναι ικανές να αλληλεπιδράσουν καθώς επίσης είναι περιττή η πρόσδεση του E(spl)m7 στο DNA. Η αποικοδόμηση του E(spl)m7 από το σύμπλοκο Da/Sc, ευνοείται όταν το Da/Sc σύμπλοκο μπορεί να προσδεθεί στο DNA. Η αποικοδόμηση του συμπλόκου Da/Sc από την E(spl)m7, δεν χρειάζεται πρόσδεση στο DNA κανενός μεταγραφικού παράγοντα, αλλά εξαρτάται από την στρατολόγηση του συγκαταστολέα Groucho. Επιπλέον, η πρωτεΐνη Sc πρέπει να είναι φωσφορυλιωμένη στο μοτίβο S²⁶⁸PTS για να καταστραφεί από την m7. Τα παραπάνω αποτελέσματα δηλώνουν ότι το σύμπλοκο Da/Sc/m7 στρατολογεί διαφορετικούς παράγοντες αποικοδόμησης (π.χ. λιγάσες E3) οι οποίοι στοχεύουν διαφορετικά στοιχεία του συμπλόκου. Μια ενδιαφέρουσα παρατήρηση κατά την διάρκεια της παρούσας μελέτης ήταν ότι η πρωτεΐνη Da όταν αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες Sc και m7, επάγει σημαντική αύξηση του μοριακού τους βάρους. Αυτή η τροποποίηση επάγεται και με αναστολή του πρωτεασώματος, υποδηλώνοντας ότι πρόκειται για μια μορφή των πρωτεϊνών Sc και m7 που είναι ασταθής. Παρόλο που και οι δύο πρωτεΐνες Sc και E(spl)m7 φέρουν μονο- και πολυ-ουβικουϊτινιλιώσεις καθώς και άλλες τροποποιήσεις υψηλού μοριακού βάρους, δεν είμαστε σε θέση ακόμα να πιστοποιήσουμε τη μοριακή φύση της τροποποίησης που επάγει το Da.