Συμβολή στην κατανόηση βιοχημικών μηχανισμών της αφαίρεσης φωσφορικού και διερεύνηση της μικροβιακής ποικιλότητας κατά την τριτοβάθμια βιολογική επεξεργασία λυμάτων.

Abstract

Phosphorus removal from wastewater is often necessary in order to prevent eutrophication of waterbodies. Enhanced Biological Phosphorus Removal is a wastewater treatment process designed for phosphorus removal by biological means. EBPR can be accomplished by exposing activated sludge in alternating anaerobic-aerobic or anaerobic-anoxic conditions. The biochemical transformations occurring during Enhanced Biological Phosphorus Removal (EBPR) under anoxic conditions and the microbial diversity of the activated sludge were the subjects addressed in the present dissertation. Anoxic EBPR offers an alternative to the conventional aerobic EBPR scheme and its implementation in full scale wastewater treatment plants would enable for simultaneous nitrogen and phosphorus removal during tertiary treatment.EBPR under anoxic conditions however is considered unreliable due to the instability problems which are occasionally reported. Although the basic outlines of the bacterial metabolism related to the EBPR are already described, the prevention of such problems requires more detailed analysis of several aspects of the bacterial metabolism as well as the description of the bacterial physiological adaptation to the variation of the environmental conditions. Moreover a number of issues regarding the bacterial groups involved in EBPR under anoxic conditions await clarification. The role of the Acinetobacter species which were initially regarded as responsible for EBPR is now considered unimportant while uncultured β-proteobacteria members of the family Rhodocyclaceae are generally accepted as being the most common Polyphosphate Accumulating Organisms (PAOs).The present dissertation aimed at elucidating certain parts of the metabolism of activated sludge grown in wastewater treatment plants designed and operated for simultaneous nitrogen and phosphorus removal from municipal wastewater. For achieving this aim two continuous flow laboratory wastewater treatment plants treating real or synthetic municipal wastewater respectively were operated. Systematic sampling and determination of the intracellular concentration of polyhydroxyalkanoates, carbohydrates and biomass total phosphorus as well as analytical determination of COD, soluble phosphate and nitrate in mixed liquor filtrates were regularly performed. A series of experiments in batch reactors, where real or synthetic wastewater and activated sludge grown in the laboratory plant were used, was conducted for a more detailed analysis of the intracellular transformations taking place during EBPR under anoxic conditions and for the comparison of municipal wastewater with acetate as substrates for anoxic or aerobic EBPR. Finally several enzymatic activities were determined in activated sludge homogenates originating from the anaerobic or the anoxic reactors of the laboratory plants in order to investigate their role in carbon, nitrogen or phosphorus intracellular transformations.The description of the bacterial diversity of the activated sludge grown in the laboratory wastewater treatment plant treating municipal wastewater and the investigation of the biological role of the major populations found was the second aim of this dissertation. This target was endorsed by the construction of 16S rRNA gene library using DNA samples from the anoxic tank of the laboratory plant and the isolation of several bacterial strains from the same tank. The succession of the denitrifying bacterial populations during biomass adaptation to the operational conditions of the same laboratory plant was depicted by analyzing the diversity of the nitrite reductase (nir) genes prior and after biomass adaptation as it was confirmed by physicochemical analyses. Nitrite reductase is a key enzyme of denitrification which is expressed by bacteria responsible for nitrate removal via dissimilatory nitrate reduction.The successive use of five different carbonaceous substrates proved that only acetate and propionate were appropriate for anoxic EBPR while the use of fumarate, malate and oxaloacetate diminished the efficiency of the process with regard to the specific phosphorus release and uptake rates. The anaerobic operation of certain Krebs cycle reactions which are involved in substrate utilization was also proved by the same experiments. The direction of the bidirectional reactions among them depends on the substrate used. Significant increase in ATP production and thus also in ATP utilization was observed when acetate or propionate were used as substrates.The operation of the glyoxylate cycle under anaerobic conditions was also verified by the detection of enzymatic activities for isocitrate lyase and malate synthase, the enzymes which catalyze the glyoxylate cycle reactions. The alkaline phosphatase and the exopolyphosphatase specific activities showed strong correlation with the specific denitrification and the specific phosphorus removal rates implying participation of these enzymes in anoxic EBPR.The simultaneous presence of both organic substrate and nitrate or oxygen in the mixed liquor of batch reactors suppressed the EBPR until the organic substrate was exhausted. During this period the biomass produced polyhydroxyalkanoates and released phosphate when intracellular polyphosphate was available. This metabolic activity, which resembled that of the anaerobic phase, was accompanied by high specific oxygen or nitrate reduction rates and verified the versatility of the bacterial metabolism and the ability of the activated sludge to adapt to several environmental changes. On the other hand these experimental results also verified the adverse effect of the presence of organic substrate in the aerobic or anoxic reactor of the treatment plant. The comparison between acetate and real municipal wastewater as substrates for anaerobic and anoxic EBPR experiments performed in batch reactors confirmed the superiority of acetate which led to higher polyhydroxyalkanoates production and higher phosphorus release and uptake rates.By constructing two nirS gene libraries using DNA samples prior and after sludge acclimatization at the operational conditions of the laboratory plant treating real wastewater, the succession of the denitrifying bacteria was shown. The most abundant nirS genes in the inoculum represented a minor fraction of the nirS gene diversity of the adapted biomass. Physicochemical analyses and also double probe Fluorescent In Situ Hybridization verified the enrichment of the activated sludge with β-proteobacteria PAOs which were the only members of the bacterial population which stored intracellular polyphosphate.The construction of a 16S rRNA gene library using DNA sample from the anoxic reactor of the laboratory system treating real wastewater revealed that the members of the phylum Proteobacteria represented the major fraction of the bacterial community. Interestingly the a large fraction of the 16S rRNA genes cloned corresponded to isolated bacterial strains with denitrifying ability which were found to comprise the majority of the culturable denitrifying bacteria diversity. Especially the Acidovorax-like β-proteobacteria which were found in the laboratory plant reactor proved to be the major denitrifying population although it does not contribute in biological phosphorus removal. A number of other denitrifying bacteria were isolated which successfully reduced nitrate to nitrogen gas. 16S rRNA genes corresponding to a number of these denitrifyers were also detected in the 16S rRNA gene library. The results of the present study revealed that bacterial species other than Candidatus Accumulibacter Phosphatis were responsible for denitrification by the activated sludge grown in the laboratory wastewater treatment.

Αντικείμενα της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσαν η κατανόηση των βιοχημικών μηχανισμών και η διερεύνηση της μικροβιακής ποικιλότητας κατά την εκτεταμένη βιολογική αφαίρεση φωσφόρου (Enhanced biological phosphorus removal- EBPR) υπό ανοξικές συνθήκες.Προκειμένου να επιτευχθούν οι παραπάνω ερευνητικοί στόχοι ήταν απαραίτητη η διαμόρφωση και λειτουργία εργαστηριακών συστημάτων επεξεργασίας αποβλήτων, συνεχούς ροής, όπου επιτυγχάνονταν ταυτόχρονη απομάκρυνση αζώτου και φωσφόρου από το επεξεργαζόμενο απόβλητο που κατά περίπτωση ήταν πραγματικό αστικό λύμα ή συνθετικό υγρό απόβλητο. Επιπλέον μια σειρά αντιδραστήρων διαλείποντος έργου λειτούργησαν με σκοπό την πραγματοποίηση πειραμάτων υπό αυστηρά καθορισμένες και ελεγχόμενες συνθήκες.Συγκεκριμένα στο πλαίσιο της διερεύνησης της μεταβολικής λειτουργίας ενεργού ιλύος προσαρμοσμένης να επιτελεί EBPR υπό ανοξικές συνθήκες εξετάστηκε η επίδραση του ανθρακούχου υποστρώματος στην αποτελεσματικότητα της βιολογικής αφαίρεσης φωσφόρου. Διαδοχικά χρησιμοποιήθηκαν τα οξικό, προπιονικό, μηλικό, φουμαρικό και οξαλοξικό οξύ ως ανθρακούχα υποστρώματα και διαπιστώθηκε ότι μόνο τα δύο πρώτα ευνοούσαν την αφαίρεση φωσφόρου ενώ αντίθετα τα υπόλοιπα ανέστειλαν τη βιολογική αυτή διεργασία. Διαπιστώθηκε επίσης ότι υπό αναερόβιες συνθήκες πραγματοποιούνται ορισμένες εκ των αντιδράσεων του κύκλου του Krebs, ενώ η φύση του ανθρακούχου υποστρώματος αποδείχθηκε ότι καθορίζει την κατεύθυνση προς την οποία επιτελούνται οι αμφίδρομες αυτές αντιδράσεις. Επιπλέον υπολογίστηκε ο συντελεστής αφομοίωσης της βιομάζας που κυμάνθηκε μεταξύ 0.22-0.24 g VSS g-1 COD, σχεδόν ίδιος για όλα τα υποστρώματα. Αντίθετα σημαντική διαφοροποίηση διαπιστώθηκε στο ρυθμό παραγωγής και κατανάλωσης ATP όταν απομακρύνονταν αποτελεσματικά τα φωσφορικά ιόντα από το μικτό υγρό, δηλαδή όταν τα οξικό ή προπιονικό χρησιμοποιήθηκαν ως υποστρώματα σε σχέση με τα υπόλοιπα τρία ενδιάμεσα του κύκλου Krebs. Πιστοποιήθηκε προσδιορίζοντας ειδικές ενζυμικές δραστικότητες σε ομογενοποιήματα ενεργού ιλύος η συμμετοχή της αλκαλικής φωσφατάσης και της εξωπολυφωσφατάσης στη διεργασία της βιολογικής αφαίρεσης φωσφόρου. Επιπλέον διαπιστώθηκε δραστικότητα ισοκιτρικής λυάσης και μηλικής συνθάσης σε ομογενοποιήματα ιλύος προερχόμενα τόσο από αναερόβιες όσο και από ανοξικές δεξαμενές, γεγονός που συνηγορεί στην αναερόβια λειτουργία των αναπληρωματικών αντιδράσεων του κύκλου του γλυοξυλικού. Επιπλέον υποδείχθηκε διαφορετικός μεταβολικός μηχανισμός για την αναερόβια αξιοποίηση των οξικού και προπιονικού από ενεργό ιλύ που επιτελεί EBPR υπό ανοξικές συνθήκες.Παρέχοντας ταυτόχρονα ηλεκτρονιακό δότη (οξικό οξύ) και δέκτη (οξυγόνο ή νιτρικά ιόντα) στην ενεργό ιλύ σε αντιδραστήρες διαλείποντος έργου προκλήθηκε αναστολή της EBPR μέχρις εξάντλησης του ηλεκτρονιακού δέκτη. Η μεταβολική συμπεριφορά της ιλύος στις συνθήκες αυτές αντιστοιχούσε σε αναερόβιες συνθήκες αν και στο μικτό υγρό υπήρχε επαρκής ποσότητα οξυγόνου ή νιτρικών ιόντων. Η εξάντληση του ανθρακούχου υποστρώματος οδήγησε το μεταβολισμό της ιλύος προς το τυπικό αερόβιο / ανοξικό σχήμα.Σε όμοιους αντιδραστήρες εξετάστηκε η χρήση αστικού λύματος αντί οξικού οξέος ως υπόστρωμα για την EBPR. Βρέθηκε ότι ο ειδικός ρυθμός πρόσληψης φωσφορικού με αστικό λύμα ήταν μειωμένος σε σχέση με τον αντίστοιχο όταν οξικό οξύ χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα της EBPR υπό ανοξικές συνθήκες. Αντίθετα δεν περιορίστηκε ο ειδικός ρυθμός πρόσληψης φωσφορικού υπό αερόβιες συνθήκες.Προκειμένου να διερευνηθεί η διαδοχή των απονιτροποιητικών βακτηριακών στελεχών κατά τη διάρκεια της προσαρμογής ενεργού ιλύος στις λειτουργικές συνθήκες εργαστηριακού συστήματος επεξεργασίας αστικού λύματος τύπου DEPHANOX πραγματοποιήθηκε ανάλυση της ποικιλομορφίας των γονιδίων nir που κωδικοποιούν το ένζυμο αναγωγάση του νιτρώδους. Διαπιστώθηκε εμφανής διαφοροποίηση της ποικιλότητας των απονιτροποιητών και εμπλουτισμός της ιλύος με συγκεκριμένους πληθυσμούς έναντι άλλων. Η διαμόρφωση του εργαστηριακού συστήματος, επηρέασε το ποσοστό ολικού φωσφόρου της βιομάζας και αύξησε τον πληθυσμό των βακτηρίων που επιτελούν EBPR (Polyphosphate Accumulating Organisms-PAOs). Νέα γονίδια nirS ταυτοποιήθηκαν στην ενεργό ιλύ που διαφέρουν από τα αντίστοιχα γονίδια ήδη χαρακτηρισμένων στελεχών βακτηρίων.Προκειμένου να αναλυθεί η βακτηριακή βιοκοινότητα της ενεργού ιλύος που αναπτύχθηκε στο εργαστηριακό σύστημα τύπου DEPHANOX και επιτελούσε EBPR υπό ανοξικές συνθήκες απομονώθηκαν από την ενεργό ιλύ σειρά αμιγών βακτηριακών στελεχών και χαρακτηρίστηκαν ως προς την απονιτροποιητική τους ικανότητα. Επιπλέον για την ίδια δεξαμενή μέσω ανάλυσης της ποικιλομορφίας των 16S rRNA γονιδίων προσδιορίστηκε η ποικιλότητα των βακτηριακών ειδών της ενεργού ιλύος. Διαπιστώθηκε ότι τόσο η πλειονότητα των απομονώσιμων απονιτροποιητικών βακτηρίων όσο και η πλειονότητα των 16S rRNA γονιδίων ανήκαν στο φύλο Proteobacteria. Ορισμένα εκ των απομονωθέντων απονιτροποιητικών στελεχών ανιχνεύθηκαν και μέσω της ανάλυσης των 16S rRNA γονιδίων πιστοποιώντας έτσι το ρόλο τους στην απομάκρυνση του αζώτου μέσω απονιτροποίησης που πραγματοποιείται στο εργαστηριακό σύστημα. Επιπροσθέτως καθώς τα παραπάνω στελέχη αποτελούσαν σημαντικό ποσοστό των απονιτροποιητικών βακτηρίων της ιλύος συμπεραίνεται ότι δεν είναι τα Candidatus Accumulibacter phosphatis υπεύθυνα για την απομάκρυνση του αζώτου, αλλά βακτήρια που ανήκουν σε άλλες φυλογενετικές γραμμές όπως τα Acidovorax-συσχετιζόμενα βακτήρια (Acidovorax και Pseudoacidovorax spp).