Modeling and separation optimization on reversed phase and hydrophilic interaction HPLC columns: application to separation of nucleosides-nucleobases

Abstract

The focus of this study is the modeling and separation optimization of solutes on two types of chromatographic columns: reversed phase (conventional particle packed and monolithic) as well as hydrophilic interaction (HILIC) columns. Different retention models are proposed for solute retention prediction under organic modifier-, pH- and/or flow rate – gradient conditions. These models are used in adequate optimization algorithms in order to find out the optimal gradient profiles, which lead to the optimal separation of a sample in the minimum total elution time. Mixtures of nucleosides and nucleobases are used as model compounds. In more details four different studies are conducted in this Thesis. The first study deals with the computer-aided separation optimization under multi-linear organic modifier gradient conditions on a conventional particle packed reversed-phase column. For this purpose the analytical solutions of the fundamental equation of the gradient elution were derived, when the retention model is expressed by . These theoretical expressions were embodied to algorithms for fitting gradient data and especially for resolution optimization and were successfully applied to separation optimization of a mixture of 16 model compounds. The second study deals with the computer-aided separation optimization under dual multi-linear flow rate/organic modifier gradients on a reversed phase monolithic column. For this purpose the numerical solution of a system of two integral equations expressed the solute elution under combined multi-linear flow rate/organic modifier gradients was embodied to prediction and optimization algorithms, which were successfully applied to separation optimization of a mixture of 14 analytes on a reversed phase monolithic column. The third study deals with the solute retention description under combined multi-linear pH/organic modifier gradients conditions on a reversed-phase column. For this purpose the analytical solutions of the fundamental equation of the gradient elution for a weak monoprotic base under dual multi-linear pH/organic modifier gradient conditions were derived, when the retention model expressed by and the effect of the eluent organic content on the retention factors of non-ionized and ionized forms of the ionogenic analyte are given by and , respectively. These expressions were embodied to simple algorithms for fitting gradient data and successfully applied to the retention description of gradient data of two solutes. The fourth study deals with the solute retention description under combined multi-linear pH/organic modifier gradients conditions on a HILIC column. For this purpose the analytical expressions derived for elution of weak monoprotic bases under simultaneous pH/ organic modifier gradient conditions in reversed phase systems were successfully used for description HILIC gradient data of three solutes, selected as representative weak monoprotic bases. To sum up we believe that the results of this thesis should be a valuable tool to chromatographers in their attempt to optimize separations in reversed-phase and hydrophilic HPLC.

Ο στόχος της διατριβής αυτής είναι η μοντελοποίηση και η βελτιστοποίηση χρωματογραφικών διαχωρισμών με τη μέθοδο της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης (HPLC). Προς τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν δύο τύποι χρωματογραφικών στηλών, στήλες αντίστροφης φάσης (μικροσωματιδιακής και μονολιθικής φύσης) και υδρόφιλης αλληλεπίδρασης. Επίσης αναπτύχτηκαν μοντέλα για την πρόβλεψη του χρόνου έκλουσης των ουσιών κάτω από συνθήκες μεταβολής της σύστασης της κινητής φάσης, του pH της κινητής φάσης καθώς και της ταχύτητας ροής και χρησιμοποιήθηκαν αλγόριθμοι βελτιστοποίησης που μπορούν να προσδιορίσουν το καλύτερο προφίλ της βαθμωτής μεταβολής που οδηγεί στον καλύτερο διαχωρισμό των ουσιών του δείγματος στον ελάχιστο συνολικό χρόνο έκλουσης. Ως πρότυπες ουσίες χρησιμοποιήθηκαν μίγματα νουκλεοζιδίων και νουκλεοβάσεων. Πιο συγκεκριμένα, στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής έγιναν 4 μελέτες: Η πρώτη μελέτη αφορούσε τη βελτιστοποίηση διαχωρισμών υπό συνθήκες πολυγραμμικής βαθμιαίας μεταβολής του οργανικού τροποποιητή σε συμβατικές μικροσωματιδιακής φύσης στήλες αντίστροφης φάσης. Προς τον σκοπό αυτό βρέθηκαν αναλυτικές εκφράσεις της θεμελιώδους εξίσωσης της βαθμωτής έκλουσης όταν το μοντέλο συγκράτησης δίνεται από τη σχέση . Οι θεωρητικές αυτές εκφράσεις ενσωματώθηκαν σε αλγορίθμους προσαρμογής και πρόβλεψης χρόνων έκλουσης ουσιών καθώς και σε αλγορίθμους βελτιστοποίησης διαχωρισμών που εφαρμόστηκαν με επιτυχία σε πειραματικά χρωματογραφικά δεδομένα. Η δεύτερη μελέτη αφορούσε τη βελτιστοποίηση διαχωρισμών υπό συνθήκες πολυγραμμικής ταυτόχρονης βαθμιαίας μεταβολής του οργανικού τροποποιητή και της ταχύτητας ροής σε μονολιθικές στήλες αντίστροφης φάσης. Προς τον σκοπό αυτό η αριθμητική λύση της θεμελιώδους εξίσωσης της βαθμωτής έκλουσης ενσωματώθηκε σε αλγορίθμους πρόβλεψης χρόνων έκλουσης ουσιών καθώς και σε αλγορίθμους βελτιστοποίησης διαχωρισμών που εφαρμόστηκαν με επιτυχία σε πειραματικά χρωματογραφικά δεδομένα. Η τρίτη μελέτη αφορούσε τη θεωρητική περιγραφή της συγκράτησης ουσιών υπό συνθήκες πολυγραμμικής ταυτόχρονης βαθμιαίας μεταβολής του οργανικού τροποποιητή και του pH της κινητής φάσης σε στήλες αντίστροφης φάσης. Προς τον σκοπό αυτό βρέθηκαν αναλυτικές εκφράσεις της θεμελιώδους εξίσωσης της βαθμωτής έκλουσης για μονοπρωτικές βάσεις όταν το μοντέλο συγκράτησης δίνεται από τη σχέση και η επίδραση της ποσότητας του οργανικού τροποποιητή στη συγκράτηση της μη-ιονισμένης και της ιονισμένης μορφής της βάσης δίνονται από τις σχέσεις και , αντίστοιχα. Οι θεωρητικές αυτές εκφράσεις ενσωματώθηκαν σε απλούς αλγορίθμους προσαρμογής χρόνων έκλουσης ουσιών που εφαρμόστηκαν με επιτυχία στην περιγραφή σχετικών πειραματικών χρωματογραφικών δεδομένων. Η τέταρτη μελέτη αφορούσε τη θεωρητική περιγραφή της συγκράτησης ουσιών υπό συνθήκες πολυγραμμικής ταυτόχρονης βαθμιαίας μεταβολής του οργανικού τροποποιητή και του pH της κινητής φάσης σε στήλες υδρόφιλης αλληλεπίδρασης. Προς το σκοπό αυτό οι αναλυτικές εκφράσεις της θεμελιώδους εξίσωσης της βαθμωτής έκλουσης για ιονικές ουσίες που αναπτύχθηκαν για χρωματογραφικά συστήματα αντίστροφης φάσης εφαρμόστηκαν με επιτυχία και στην περιγραφή χρωματογραφικών δεδομένων υδρόφιλης αλληλεπίδρασης. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής πιστεύουμε ότι θα μπορούσαν να αποτελέσουν ένα πολύτιμο εργαλείο για τους επιστήμονες που ασχολούνται με την υγρή χρωματογραφία στην προσπάθεια τους να βελτιστοποιήσουν διαχωρισμούς σε στήλες αντίστροφης φάσης και υδρόφιλης αλληλεπίδρασης.