Γενετική τροποποίηση του μύκητα Fusarium Oxysporum με στόχο τη δημιουργία στελεχών με αυξημένη παραγωγικότητα αιθανόλης

Abstract

Biofuels are the liquid, mainly, fuels that are produced from renewable sources, such as the raw materials of plant or animal origin, through biological activity. The third generation biofuels are currently the edge of the research in this scientific area, and they derive from genetically modified plants, with increased CO2 adsorption, and microorganisms, with higher efficiency in ethanol production, and biomass degradation in a one-step process. In the present PhD Thesis, probable ways of increasing the ethanol productivity from lignocellulosics were examined, by modificating genetically the strain F3 of F. oxysporum. This specific microorganism bears the appropriate enzymatic system to degrade cellulose and hemicelluloses, as well the ability to ferment glucose and xylose to ethanol. Phosphoglucomutase is a key enzyme in the glycolysis pathway. Previous studies demonstrated that glucose-1,6-biphosphate, intermediate metabolite of the conversion of glucose-1-phosphate to glucose-6-phosphate and vice versa, accumulated during glucose fermentation, indicating a potential low activity of phosphoglucomutase in the wild type strain. The improvement of the efficiency could be achieved through either enzyme engineering or overexpression attempts. In the first case, the biochemical characterization of the enzyme is necessary, to evaluate the effects of the genetic modifications on the enzyme function. Even though, in the present Thesis, the effects of phosphoglucomutase overexpression on ethanol productivity were examined, the enzyme was isolated and characterized biochemically, as part of the first steps for a possible future genetic reconstruction. Thus, the molecular weight was determined to 58 kDa, the isoelectric point to 3.5, the optimal pH to 7 and optimal temperature to 40 oC. The low stability of the enzyme in temperatures higher than 40 oC and the influence of several cations were also acknowledged. The Ca2+ cations inhibited the enzyme activity more strongly than the rest of the bivalent ions examined. The kinetic mechanism of phosphoglucomutase was also investigated, leading to the conclusion that it follows the Ping Pong mechanism. As far as the impact of the phosphoglucomutase overexpression on ethanol productivity was concerned, the strain F3 of F. oxysporum was genetically modified to achieve a strong and constitutive expression of the phosphoglucomutase gene of Aspergillus nidulans. The appropriate vector was constructed, which contained the pgm gene inserted between the gpdA promoter and the trpC terminator of A. nidulans. The microorganism was co-transformed with the constructed vector, as well as a plasmid bearing the resistance gene for hygromycin B. This process resulted in two strains whose successful insertion and expression of the gene was confirmed with PCR, Southern and northern analyses and enzymatic assays. Nevertheless, the transformants didn’t exhibit higher ethanol productivities than the wild type. The strain F3 of F. oxysporum was then genetically modified in order to continuously express its own phosphoglucomutase and transaldolase genes. Transaldolase catalyses the conversion of sedoheptulose-7-P and glyceraldehydes-3-P to erythrose-4-P and fructose-6-P, connecting the non-oxidative part of the pentose phosphate pathway with glycolysis. Previous studies demonstrated the accumulation of sedoheptulose-7-P, indicating that the wild type of the microorganism could be exhibit low activity of this specific enzyme. Appropriate vectors were constructed, where the pgm and tal genes of F. oxysporum were to be regulated by the constitutive gpdA promoter of A. nidulans. The co-transformation was performed through protoplastation and the eleven hygromycin resistant strains that were confirmed to having integrated the construct through PCR, were also analyzed with Southern and northern blot and enzymatic assays. The transformant FF11, which exhibited the highest activities for both enzymes, was chosen and its behavior and ethanol productivity, compared to the wild type, were further investigated in a batch bioreactor. The growth parameters were determined in glucose and xylose medium, as well as the ethanol production, in anaerobic or microaerobic conditions, and the concentrations of intra and extracellular metabolites. The transformant, in glucose medium, exhibited lower maximum specific growth rate, during the aerobic phase, than the wild type strain F3, as well as higher ethanol yield, during fermentation. Also, the acetic acid yield was lower. Acetic acid is a major by-product in ethanol producing processes. In xylose medium, the transformant maximum specific growth rate was higher, during the aerobic growth phase, but the ethanol yield was lower and the acetic acid yield was higher than the wild type, during fermentation. According to the above data, the transformant strain FF11 is more efficient than F3 when fermenting glucose to ethanol, but less efficient when grown in xylose. Nevertheless, the increased concentrations of the intracellular metabolites, during the xylose fermentation, could be explained by an increase of the metabolic rate, due to the overexpression of the transaldolase, bringing the ethanol productivity to a decline due to a probable imbalance of co-factors NAD+ and NADP+.Lastly, the genetic modification of F3 strain of F. oxysporum, in order to express continuously and independently the endo-1,4-β-xylanase gene, was accomplished. The transformation was achieved through Agrobacterium tumefaciens and resulted in twelve hygromycin resistant strains, which exhibited xylanase activity regardless of the presence of inducing factors. The insertion of the gene was confirmed with Southern and northern analyses. The strains displaying the highest xylanase activity, when grown in glucose medium, produced more ethanol than the wild type F3 strain and maintained the high enzyme activity levels, during the fermentation of corn cob. When grown in a medium containing xylan, a natural xylanase inducer, the enzymatic activity was similar in both transformants and the wild type strain.

Βιοκαύσιμα θεωρούνται τα υγρά κυρίως καύσιμα που προέρχονται από ανανεώσιμες πηγές, όπως είναι οι πρώτες ύλες φυτικής ή ζωικής προέλευσης και παράγονται από βιολογική δραστηριότητα. Τα βιοκαύσιμα τρίτης γενιάς αποτελούν την αιχμή της επιστημονικής έρευνας στον τομέα αυτό, καθώς παράγονται από γενετικώς τροποποιημένα φυτά, με αυξημένη ικανότητα πρόσληψης διοξειδίου του άνθρακα, και μικροοργανισμούς, με αυξημένη απόδοση στην παραγωγή αιθανόλης, καθώς και υψηλή ικανότητα διάσπασης της φυτικής βιομάζας και ζύμωσή της σε αιθανόλη σε διεργασία ενός σταδίου. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή διερευνήθηκαν πιθανοί τρόποι αύξησης της παραγωγής αιθανόλης από λιγνινοκυτταρινούχες πηγές, τροποποιώντας γενετικά το στέλεχος F3 του F. oxysporum. Ο μικροοργανισμός αυτός διαθέτει το κατάλληλο ενζυμικό σύστημα για την αποικοδόμηση της κυτταρίνης και της ημικυτταρίνης, όπως και την ικανότητα βιομετατροπής της γλυκόζης και της ξυλόζης σε αιθανόλη. Η φωσφογλυκομουτάση αποτελεί κομβικό σημείο της γλυκόλυσης. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν, κατά τη ζύμωση της γλυκόζης, συσσώρευση της 1,6- διφωσφορικής γλυκόζης, ενδιάμεσου μεταβολίτη της μετατροπής της 1-φωσφορικής γλυκόζης σε 6-φωσφορική γλυκόζη και αντίστροφα, υποδεικνύοντας ενδεχόμενη υπολειτουργία του ενζύμου της φωσφογλυκομουτάσης στο φυσικό στέλεχος. Η βελτίωση της λειτουργίας του θα μπορούσε να επιτευχθεί είτε μέσω ενζυμικής μηχανικής είτε μέσω υπερέκφρασης. Στην πρώτη περίπτωση είναι απαραίτητος ο βιοχημικός χαρακτηρισμός του ενζύμου, προκειμένου να εκτιμηθούν, ακολούθως οι ενδεχόμενες επιπτώσεις των γενετικών μεταβολών στη λειτουργία του ενζύμου. Αν και στην παρούσα εργασία επιλέχθηκε να εξεταστούν οι συνέπειες της υπερέκφρασης της φωσφογλυκομουτάσης στην παραγωγικότητα της αιθανόλης από το F. oxysporum, τέθηκαν, ωστόσο, και οι βάσεις για το μελλοντικό ανασχεδιασμό του ενζύμου με μεθόδους ενζυμικής μηχανικής. Στο πλαίσιο αυτό, το ένζυμο απομονώθηκε και αναλύθηκαν οι ιδιότητές του. Το μοριακό του βάρος προσδιορίστηκε στα 58 kDa, το ισοηλεκτρικό σημείο στο 3,5, οι άριστες συνθήκες pH και θερμοκρασίας, σε pH 7 και θερμοκρασία 40 οC αντίστοιχα, ενώ αναγνωρίστηκε η –χαμηλή - σταθερότητά του σε τιμές θερμοκρασίας μεγαλύτερες των 40 οC και η επίδραση διαφόρων μεταλλικών ιόντων, με τα ιόντα Co2+ να συσχετίζονται με την υψηλότερη ενζυμική ενεργότητα, ενώ τα ιόντα Ca2+ να ενεργοποιούν το ένζυμο λιγότερο ισχυρά από τα υπόλοιπα μελετημένα δισθενή ιόντα. Επίσης, διερευνήθηκε το κινητικό μοντέλο του ενζύμου, το οποίο ακολουθεί το μηχανισμό Ping Pong. Όσον αφορά στη διερεύνηση των συνεπειών της υπερέκφρασης της φωσφογλυκομουτάσης στον F. oxysporum, πραγματοποιήθηκε γενετική τροποποίηση του στελέχους F3 του F. oxysporum έτσι ώστε να επιτευχθεί η ισχυρή και συνεχής έκφραση του γονιδίου της φωσφογλυκομουτάσης του Aspergillus nidulans. Κατασκευάστηκε ο κατάλληλος φορέας κλωνοποίησης, που περιείχε το γονίδιο της φωσφογλυκομουτάσης ανάμεσα στον υποκινητή του gpdA και την αλληλουχία λήξης της μεταγραφής του trpC του Α. nidulans. Ο μικροοργανισμός συμμετασχηματίστηκε με τον φορέα αυτό, καθώς και ένα πλασμίδιο που φέρει το γονίδιο ανθεκτικότητας στην υγρομυκίνη Β. Από τη διαδικασία αυτή προέκυψαν στελέχη, στα οποία επιβεβαιώθηκε η επιτυχής εισαγωγή και έκφραση του γονιδίου, με αντίδραση PCR, ανάλυση κατά Southern και northern και ενζυμικές δοκιμές. Παρόλα αυτά, τα μετασχηματισμένα στελέχη δεν εμφάνισαν υψηλότερη παραγωγή αιθανόλης από το στέλεχος φυσικού τύπου, κατά τη ζύμωση της γλυκόζης. Αντίστοιχα, πραγματοποιήθηκε γενετική τροποποίηση του στελέχους F3 του F. oxysporum προκειμένου να επιτευχθεί ομόλογα η συνεχής και ισχυρή έκφραση των γονιδίων της φωσφογλυκομουτάσης και της τρανσαλδολάσης. Η τρανσαλδολάση καταλύει τη μετατροπή της 7-φωσφορικής σεδοεπτουλόζης και της 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης σε 4-φωσφορική ερυθρόζη και 6-φωσφορική φρουκτόζη, συνδέοντας έτσι το μη-οξειδωτικό τμήμα του μονοπατιού των φωσφορικών πεντοζών με τη γλυκόλυση. Σε προηγούμενες μελέτες, παρατηρήθηκε συσσώρευση της 7-φωσφορικής σεδοεπτουλόζης, γεγονός που υποδεικνύει ενδεχόμενη υπολειτουργία του συγκεκριμένου ενζύμου στο φυσικό στέλεχος του μικροοργανισμού. Η υπερέκφραση του θα μπορούσε να αυξήσει το μεταβολικό ρυθμό και την παραγωγικότητα της αιθανόλης. Έτσι, κατασκευάστηκαν κατάλληλοι φορείς κλωνοποίησης, στους οποίους τα γονίδια της φωσφογλυκομουτάσης και της τρανσαλδολάσης ελέγχονταν από τον υποκινητή συνεχούς έκφρασης του gpdA του A. nidulans. Ο συμμετασχηματισμός επιτεύχθηκε με τη μέθοδο των πρωτοπλαστών και στα 11 στελέχη που προέκυψαν επιβεβαιώθηκε η ενσωμάτωση με ανάλυση κατά Southern και northern και προσδιορίστηκαν οι ενεργότητες των δύο ενζύμων. Το στέλεχος FF11, το οποίο παρουσίασε υψηλές ενεργότητες και στα δύο ένζυμα, επιλέχθηκε για να ελεγχθεί η συμπεριφορά του σε κλειστή καλλιέργεια βιοαντιδραστήρα και η παραγωγικότητά του σε αιθανόλη, σε σύγκριση με το φυσικό στέλεχος F3. Προσδιορίστηκαν οι παράμετροι αύξησης σε θρεπτικό υπόστρωμα γλυκόζης και ξυλόζης, η παραγωγή αιθανόλης σε αναερόβιες ή μικροαερόβιες συνθήκες, καθώς και οι συγκεντρώσεις των εσω και εξωκυτταρικών μεταβολιτών. Το τροποποιημένο στέλεχος, σε θρεπτικό υπόστρωμα γλυκόζης, παρουσίασε χαμηλότερο μέγιστο ειδικό ρυθμό αύξησης, κατά την αερόβια φάση αύξησης, από το φυσικό στέλεχος F3 και υψηλότερη απόδοση αιθανόλης-υποστρώματος (γλυκόζης), κατά τη φάση ζύμωσης. Επίσης, χαμηλότερη ήταν η απόδοση οξικού οξέος-υποστρώματος. Το οξικό οξύ αποτελεί βασικό παραπροϊόν των διεργασιών παραγωγής βιοαιθανόλης. Σε θρεπτικό υπόστρωμα ξυλόζης, το τροποποιημένο στέλεχος εμφάνισε υψηλότερο ειδικό ρυθμό αύξησης κατά την αερόβια φάση αύξησης, αλλά χαμηλότερη απόδοση αιθανόλης-υποστρώματος και υψηλότερη απόδοση οξικού οξέος-υποστρώματος. Τα παραπάνω καθιστούν το τροποποιημένο στέλεχος FF11 αποδοτικότερο από το F3 στη ζύμωση της γλυκόζης για την παραγωγή αιθανόλης, αλλά λιγότερο αποδοτικό στη ζύμωση της ξυλόζης. Οι αυξημένες συγκεντρώσεις των εσωκυτταρικών μεταβολιτών, κατά τη φάση ζύμωσης της ξυλόζης, ωστόσο, υποδεικνύουν μια αύξηση του μεταβολικού ρυθμού, λόγω της υπερέκφρασης της τρανσαλδολάσης, μετατοπίζοντας ενδεχομένως το πρόβλημα της χαμηλής απόδοσης σε αιθανόλη στην ισορροπία των συμπαραγόντων NAD+ και NADP+. Τέλος, πραγματοποιήθηκε γενετική τροποποίηση του στελέχους F3 του F. oxysporum για να επιτευχθεί η συνεχής και ανεξάρτητη ρύθμισης έκφραση του γονιδίου της ενδο-1,4-β-ξυλανάση 2. Ο μετασχηματισμός επιτεύχθηκε μέσω του Agrobacterium tumefaciens και προέκυψαν δώδεκα στελέχη που παρουσίασαν υψηλή ενεργότητα ξυλανάσης, ανεξάρτητα της παρουσίας επαγωγικών παραγόντων. Η ενσωμάτωση του γονιδίου επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κατά Southern και η μεταγραφή του με ανάλυση κατά northern. Τα στελέχη με τις υψηλότερες ενεργότητες ξυλανάσης, όταν είχαν αναπτυχθεί αερόβια σε υπόστρωμα γλυκόζης, παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα παραγωγής αιθανόλης συγκριτικά με το φυσικό στέλεχος, κατά τη ζύμωση θρυμματισμένου σπάδικα αραβοσίτου, και διατήρησαν τα υψηλά επίπεδα ξυλανάσης σε όλη τη διάρκεια της αναερόβιας φάσης. Ωστόσο, όταν αναπτύχθηκαν σε υπόστρωμα ξυλάνης, η ενζυμική ενεργότητα για τα ίδια στελέχη ήταν παρόμοια του φυσικού.