Η κλινική σημασία της έκφρασης των πρωτεϊνών FAK και c - SRC στα νεοπλάσματα του παγκρέατος

Abstract

Focal adhesion Kinase (FAK), a member of the Protein Tyrosine Kinases (PTKs)family, is characterised by its subcellular localisation to specialised submembranousstructures called focal adhesions (FAs). Signaling through FAK has been implicated in theregulation of various basic cellular functions. The first interacting molecule in the signalingcascade is another tyrosine kinase, Src. The interaction between FAK and Src results in thefull activation of the first and further the phosphorylation of several enzymes, such as Grb2,PI3K, p130Cas, resulting in the regulation of cellular proliferation, adhesion, survival andmovement in the microenviroment.A number of studies, including ιn vitro and in vivo studies on animal and humancellular lines and tissues, have proven the role of FAK and v-Src, the Rous sarcoma virustransformedhyperactive Src, in the malignant cellular transformation and cancer progress.Recent studies, with encouraging results, are investigating the potential use of FAK and Srcinhibitors as chemotherapeutic agents.Purpose of the studyThe purpose of this study is to investigate the role of the two enzymes specifically inthe pancreatic adenocarcinoma. The immunohistochemical characteristics of the twokinases: expression, intesity and overexpression of staining, were investigated for potentialcorrelations with clinicopathological parameters of the sample, such as patients' age andgender, tumours' stage, grade and proliferation index (Ki-67).Clinical sample and methodsThe sample was consisted of 65 surgically excised pancreatic adenocarcinomaspecimens. The mean age of the patients was 65.68 ± 9.42 years (range 43-84 years).Follow-up was until death. The histological specimens were examined with conventionalimmunohistochemistry techniques. Potential correlations between the stainingcharacteristics of the two enzymes and the sample's clinicopathological parameters wereinvestigated with the use of the appropriate statistical test. Furthermore, statistical models~ 30 ~were constructed aiming to predict clinicopathological characteristics based on theenzymatic staining characteristics.Results• Tumours with increased (moderate and intense) intensity of FAK immunostaining are3.4times more likely in patients younger than 65 years of age (OR=3.375, CI=1.163-9.792,p=0.025).• A trend was identified between patient's gender and the intesity of Src immunostaining(p=0.098). Tumours with increased (moderate and intense) staining intensity were 6 timesmore likely in female patients (OR=6.123, CI=2.031-18,460, p=0.001).• Tumours' grade significantly correlated with FAK expression (p=0,020). More specifically,increased FAK staining intensity was identified as an independent prognostic factor fortumours' grade (OR=8.593, CI=1.007-73.319, p=0.049). Tumours with low (absent orweak) intensity levels were 13.3 times more likely to be of low grade (grade 1)(OR=13.333, CI=1.069-166.374, p=0.044).• A trend was identified between AJCC stage and FAK overexpression (p=0.053). AJCCstage was significantly correlated with Src overexpression (p=0.014), with more stage Iand II tumours overexpressing the kinase, being also an independent prognostic factor(OR=7, CI=1.3-37.704, p=0.024 for stage III neoplasms).• A trend was reported between T stage and the overexpression of both FAK (p=0.113) andSrc (p=0.130).• M stage was significantly correlated with FAK expression (p=0.004), with all M1 tumoursexpressing the enzyme, while a significant portion of the M0 ones being negative.• M stage was significantly correlated with the intensity of FAK immunostaining (p=0.003),with all M1 tumours presenting weak intensity of staining, in contrast to M0 ones, which inhigher proportion presented moderate intensity.• A trend was discovered betwewen M stage and FAK (p=0.107) and Src overexpression(p=0.098).• A trend was identified between longer patients' survival and Src expression (p=0.119) andincreased intensity of immunostaining (p=0.162).~ 31 ~• Longer survival was significantly correlated with Src overexression (p=0.027), withpatients suffering from tumours that did not present Src overexpression being at about1.7 times higher risk for reduced survival (HR= 1.674, CI= 1.003-2.795, p=0.049).ConclusionsThis study has identified significant correlations between the staining characteristics ofthe two enzymes and clinicopathological parameters of patients with pancreaticadenocarcinoma. In this way, along with a small number of published evidence, our effortapproached the clinical significance of the two kinases in the pathophysiology of pancreaticadenocarcinoma, sup[porting the value and significance of research efforts in the field ofstudying FAK and Src inhibitors as chemotherapeutic agents for pancreatic cancer.

Η Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (Focal Adhesion Kinase, FAK), μέλος τηςοικογένειας των κινασών της τυροσίνης (Protein Tyrosine Kinases, PTKs), έχειχαρτογραφηθεί στις κυτταρικές θέσεις εστιακής προσκόλλησης (Focal Adhesions, FAs) καιενοχοποιηθεί για τη ρύθμιση μιας πληθώρας οδών διάδοσης μηνυμάτων ελέγχου πολλώνβασικών κυτταρικών λειτουργιών. Το μόριο εκείνο με το οποίο αλληλεπιδρά το ένζυμο FAKστην αρχή του καταρράκτη ενεργοποίησής του είναι το Src, μια ακόμη κινάση της τυροσίνης.Η προσκόλληση του μορίου Src σε εκείνο του FAK έχει ως συνέπεια την πλήρηενεργοποίηση του δεύτερου και τη φωσφορυλίωση διαφόρων μορίων, όπως τα Grb2, PI3K,p130Cas κ.α., με τελικό αποτέλεσμα τον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, τηςκυτταρικής προσκόλλησης και επιβίωσης, καθώς και της μετακίνησης των κυττάρων στομικροπεριβάλλον.Πλήθος ερευνών, συμπεριλαμβανομένων ιn vitro και in vivo σε ζωικές και ανθρώπινεςκυτταρικές σειρές και ιστολογικά δείγματα, έχουν αποδείξει το ρόλο του ενζύμου FAK, αλλάκαι του v-Src, εξαλλαγμένη από τον ογκογόνο ιό Rous sarcoma virus μορφή του ενζύμου Srcβρισκόμενη σε κατάσταση υπερλειτουργίας, στην εξαλλαγή των κυττάρων και την πρόοδοτης καρκινικής νόσου. Τέλος, νεότερες έρευνες κατευθύνονται στην πιθανή χρήση ουσιώνκαι μορίων κατευθυνόμενων εναντίον των κινασών FAK και Src ως αντινεοπλασματικώνπαραγόντων, με τα αποτελέσματα μέχρι στιγμής να είναι ενθαρρυντικά.Σκοπός της παρούσας έρευναςΣτο ενδιαφέρον αυτό πεδίο έρευνας η παρούσα διδακτορική διατριβή ασχολείται με τορόλο των δυο ενζύμων ειδικά στο αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος. Ειδικότερα ταχαρακηριστικά ανοσοϊστοχημικής χρώσης των δύο κινασών: έκφραση, ένταση καιυπερέκφραση χρώσης, αξιολογήθηκαν για την ύπαρξη σημαντικών συσχετίσεων μεκλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά του δείγματος, όπως η ηλικία, το φύλο και η επιβίωσητου ασθενούς, καθώς και το στάδιο (stage), ο ιστολογικός βαθμός κακοήθειας (grade) και ορυθμός κυτταρικού πολλαπλασιασμού του όγκου (δείκτης Ki-67).~ 26 ~Κλινικό δείγμα και μέθοδοςΤο κλινικό δείγμα της παρούσας έρευνας αποτέλεσαν 65 ιστολογικά δείγματααδενοκαρκινώματος του παγκρέατος, μετά από τη χειρουργική τους αφαίρεση. Η μέση ηλικίατων ασθενών ήταν 65,68 ± 9,42 έτη (διασπορά 43-84 έτη) και η παρακολούθησή τους έγινεμέχρι το θάνατό τους. Οι ιστολογικές τομές εξετάστηκαν με τις συνήθεις ανοσοϊστοχημικέςμεθόδους. Η πιθανή συσχέτιση των ενζυμικών χαρακτηριστικών ανοσοϊστοχημικής χρώσηςμε τα αναφερθέντα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά αξιολογήθηκε με τη χρήση τουκατάλληλου στατιστικού τεστ. Επίσης, με τη χρήση στατιστικών μεθόδων, προσεγγίστηκε ηδημιουργία μοντέλων πρόβλεψης των κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικών με βάση ταενζυμικά χαρακτηριστικά.Αποτελέσματα• Όγκοι με αυξημένα επίπεδα έντασης (μέτρια ή ισχυρή ένταση) FAK ανοσόχρωσης είναιπιθανότερο κατά 3,4 περίπου φορές να συναντηθούν σε ασθενείς μικρότερους των 65ετών (OR=3,375, CI=1,163-9,792, p=0,025).• Το φύλο του ασθενούς παρουσίασε τάση συσχέτισης με την ένταση της Srcανοσόχρωσης του (p=0,098). Όγκοι με αυξημένα επίπεδα έντασης (μέτρια ή ισχυρήένταση) Src ανοσόχρωσης είναι πιθανότερο κατά 6 περίπου φορές να συναντηθούν σεγυναίκες ασθενείς (OR=6,123, CI=2,031-18,460, p=0,001).• Ο ιστολογικός βαθμός κακοήθειας των νεοπλασμάτων εμφανίστηκε να συσχετίζεταισημαντικά με την έκφραση του ενζύμου FAK και μάλιστα να αυξάνεται με την αύξηση τηςένταση της FAK χρώσης (p=0,020). Πιο συγκεκριμένα, η αυξημένη ένταση FAKανοσόχρωσης αναγνωρίστηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για το βαθμόιστολογικής κακοήθειας (OR=8,593, CI=1,007-73,319, p=0,049). Όγκοι με μειωμέναεπίπεδα έντασης (μηδενική ή χαμηλή ένταση) FAK ανοσόχρωσης είναι πιθανότερο κατά13,3 περίπου φορές να είναι χαμηλού ιστολογικού βαθμού κακοήθειας (grade 1)(OR=13,333, CI=1,069-166,374, p=0,044).• Το στάδιο της νόσου κατά AJCC εμφάνισε τάση συσχέτισης με την υπερέκφραση τουενζύμου FAK (p=0,053), ενώ συσχετίστηκε σημαντικά με την υπερέκφραση του ενζύμουSrc (p=0,014), με περισσότερους όγκους σταδίου Ι και ΙΙ να υπερεκφράζουν το ένζυμο,όντας, επίσης, και ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας (OR=7, CI=1,3-37,704,p=0,024 για τα νεοπλάσματα σταδίου ΙΙΙ).~ 27 ~• Το στάδιο Τ κατά ΤΝΜ παρουσίασε τάσεις συσχέτισης με την υπερέκφραση των κινασώνFAK (p=0,113) και Src (p=0,130).• Το στάδιο Μ κατά ΤΝΜ συσχετίστηκε σημαντικά με την έκφραση του ενζύμου FAK(p=0,004), με όλους τους όγκους με απομακρυσμενές μεταστάσεις να εκφράζουν τηνκινάση, ενώ ένα σημαντικό ποσοστό από εκείνους σταδίου Μ0 να είναι αρνητικοί γιααυτή.• Το στάδιο Μ συσχετίστηκε σημαντικά με την ένταση της FAK ανοσόχρωσης (p=0,003), μεόλους τους όγκους σταδίου Μ1 να παρουσιάζουν ασθενή χρώση για το ένζυμο, σεαντίθεση με εκείνους σταδίου Μ0 που σε υψηλότερο ποσοστό εμφάνισαν μέτρια έντασηανοσόχρωσης.• Το στάδιο M κατά ΤΝΜ παρουσίασε τάσεις συσχέτισης με την υπερέκφραση τωνενζύμων FAK (p=0,107) και Src (p=0,098).• Η καλύτερη επιβίωση των ασθενών εμφάνισε τάσεις συσχέτισης με την έκφραση τουενζύμου Src (p=0,119) και την αυξημένη ένταση ανοσόχρωσής του (p=0,162).• Η καλύτερη επιβίωση των ασθενών συσχετίστηκε σημαντικά με την υπερέκφραση τηςπρωτεΐνης Src (p=0,027), με το σχετικό κίνδυνο για μικρότερη επιβίωση να αυξάνεταικατά περίπου 1,7 φορές στους ασθενείς με όγκους που δεν υπερέκφρασαν την κινάση(HR= 1,674, CI= 1,003-2,795, p=0,049).ΣυμπεράσματαΗ παρούσα έρευνα συσχέτισε χαρακτηριστικά έκφρασης των δύο ενζύμων με διάφορακλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των παγκρεατικών αδενοκαρκινωμάτων και τωνασθενών. Κατά αυτόν τον τρόπο, η παρούσα μελέτη, μαζί με ένα μικρό αριθμό παρόμοιωνδημοσιευμένων ερευνών, προσέγγισε τον κλινικό ρόλο των δύο κινασών στην εξέλιξη τουαδενοκαρκινώματος του παγκρέατος και ενίσχυσε τη σημασία της συνέχισης διεξαγωγήςερευνών πάνω στην πιθανή χρήση αναστολέων των δύο κινασών ως χημειοθεραπευτικώνπαραγόντων στη θεραπεία του.