Μελέτη mecA - θετικών κλινικών στελεχών staphylococcus aureus με διαφορετικά επίπεδα αντοχής στη μεθικιλλίνη

Abstract

Depending on the genetic background of the strain that carries mecA, resistance levels range from phenotypically susceptible to highly resistant. Characteristic for most MRSA is the heterogeneous expression of resistance, which is due to the seggregation of a more highly resistant subpopulation upon challenge with methicillin. Maximal expression of resistance by PBP2' requires the efficient and correct synthesis of the peptidoglycan precursor. Genes involved in cell-wall precursor formation and turnover, regulation, transport, and signal transduction may determine the level of resistance that is expressed. At this stage, however, there is no information available on the functionality or efficacy of such factors in clinical isolates in relation to methicillin resistance levels.Community-type Staphylococcus aureus strains that are positive for mecA and PBP2a but appear phenotypically susceptible to oxacillin are increasingly reported worldwide. For this reason, four S. aureus clinical isolates carrying the mecA gene with oxacillin MICs of <2 microg/ml were tested for oxacillin efficiency by population analyses and experimental thigh infections. These isolates harbored staphylococcal cassette chromosome mec type IV and belonged to two genotypes. Two of the four isolates were found by population analysis to be truly oxacillin susceptible. All four isolates exhibited significant reductions in the numbers of colonies grown after dicloxacillin treatment of experimental thigh infections, as also did a mecA-negative S. aureus control strain. These observations indicate that some of the phenotypically oxacillin susceptible mecA-positive Staphylococcus aureus isolates may be at least partially responsive to oxacillin.In parallel, in order to gain molecular and functional insights on this observation, we focused on additional factors possibly contributing to phenotypic susceptibility. The nucleotide content of mecA, femA, femB and femX genes, which are considered essential for methicillin resistance, was determined in four SCCmec-IV type OS-MRSA clinical isolates. Gene expression was quantified compared with the low- and a high-level MRSA (MIC 256 mg/L) control. The tertiary structure of Fem proteins was predicted based on protein structure homology modelling, using web-based automated comparative protein modelling. Growth kinetics were tested for the study and control isolates, to determine whether FemXAB mutations lead to reduced fitness. Genes mecA, femA, femB and femX were expressed similarly in the study and the control isolates. Mutations in the gene mecA were not present in any isolate. However, several mutations leading to amino acid substitutions in positions possibly affecting Fem enzyme activity were detected in all fem genes. Two OS-MRSA that had no oxacillin heteroresistance, had more mutations in the Fem proteins compared with the remaining isolates that were heteroresistant. The low-level MRSA control had considerably fewer mutations. No differences between growth rates of the OS-MRSA and the MRSA controls were observed. Accumulation of amino acid changes in Fem proteins might affect intact cell wall synthesis, even though not causing reduced viability, thus contributing to atypical oxacillin responsiveness.Finally, we compared the activity of dicloxacillin with that of vancomycin against 15 oxacillin-susceptible, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (OS-MRSA) clinical isolates. By population analyses, we found that 6 OS-MRSA isolates were able to grow in the presence of up to 8 mg/L dicloxacillin and 9 isolates were able to grow in 12 to >32 mg/L dicloxacillin; all isolates grew in up to 2 mg/L vancomycin. Both drugs exhibited similar bactericidal activities. In experimental infections, the therapeutic efficacy of dicloxacillin was significant (P < 0.05 versus untreated controls) in 10 OS-MRSA isolates and vancomycin was effective (P < 0.05) against 12 isolates; dicloxacillin had an efficacy that was comparable to that of vancomycin (P > 0.05) in 8 isolates. The favorable response to dicloxacillin treatment might suggest that antistaphylococcal penicillins could be used against OS-MRSA infections.

Ανάλογα με το γενετικό υπόβαθρο κάθε στελέχους που φέρει το γονίδιο mecA, τα επίπεδα αντοχής μπορεί να κυμαίνονται από φαινοτυπική ευαισθησία έως υψηλή αντοχή. Χαρακτηριστικό πολλών στελεχών MRSA αποτελεί η ετερογενής έκφραση της αντοχής, η οποία οφείλεται στον διαχωρισμό ενός ισχυρά ανθεκτικού υποπληθυσμού μετά από έκθεση σε μεθικιλλίνη. Η μέγιστη έκφραση αντοχής από την μεταλλαγμένη πενικιλλινο-δεσμευτική πρωτεΐνη PBP2΄ απαιτεί την ορθή και αποτελεσματική σύνθεση των προδρόμων μορίων της πεπτιδογλυκάνης. Τα γονίδια που εμπλέκονται στη σύνθεση και αποικοδόμηση των πρόδρομων του κυτταρικού τοιχώματος, τη ρύθμιση, τη μεταφορά και μεταγωγή σήματος μπορεί να καθορίσουν το επίπεδο αντοχής που εκφράζεται. Σε αυτό το στάδιο, ωστόσο, δεν υπάρχουν πληροφορίες διαθέσιμες σχετικά με τη λειτουργία ή την αποτελεσματικότητα αυτών των παραγόντων στα κλινικά στελέχη, σε σχέση με τα επίπεδα αντοχής στη μεθικιλλίνη.Στελέχη S. aureus της κοινότητας που φέρουν το mecA γονίδιο και την PBP2’ αλλά εμφανίζουν φαινοτυπικά ευαισθησία στην οξακιλλίνη (OS-MRSA, oxacillin MIC ≤ 2 mg/L) αναφέρονται όλο και περισσότερο παγκοσμίως, με μία σαφή αναφορά να υπάρχει και από το ΠΓΝ Λάρισας. Για το λόγο αυτό, αρχικά μελετήσαμε τέσσερα κλινικά στελέχη S. aureus που φέρουν το mecA γονίδιο με MIC στην οξακιλλίνη <2mg/L και ακολούθησε μελέτη της απόκρισης αυτών στην οξακιλλίνη με πληθυσμιακές αναλύσεις και πειραματικές λοιμώξεις σε επίμυες. Τα στελέχη αυτά έχουν SCCmec τύπου IV και ανήκουν σε δύο γονότυπους. Δύο από τα τέσσερα στελέχη βρέθηκαν, από την πληθυσμιακή ανάλυση, να είναι πραγματικά ευαίσθητα στην οξακιλλίνη. Και τα τέσσερα στελέχη εμφάνισαν σημαντικές μειώσεις στον αριθμό των αποικιών που αναπτύχθηκαν μετά από θεραπεία με δικλοξακιλλίνη κατά τη διαδικασία των πειραματικών λοιμώξεων σε μηρό, κάτι που έγινε επίσης για ένα στέλεχος ελέγχου (control) S. aureus που είναι mecA αρνητικό. Οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν ότι ορισμένα από τα φαινοτυπικά ευαίσθητα στην οξακιλλίνη mecA-θετικά στελέχη S. aureus μπορεί, τουλάχιστον εν μέρει, να ανταποκρίνονται στην οξακιλλίνη.Παράλληλα, εστιάσαμε σε επιπρόσθετους παράγοντες που μπορεί να συμβάλουν στην φαινοτυπική ευαισθησία με στόχο να αποκτήσουμε γνώσεις σε μοριακό και λειτουργικό επίπεδο. Διερευνήσαμε το νουκλεοτιδικό περιεχόμενο των femA, femB και femX γονιδίων, τα οποία θεωρούνται απαραίτητα για την αντοχή στη μεθικιλλίνη, σε τέσσερα κλινικά στελέχη OS-MRSA του SCCmec-IV τύπου. Πραγματοποιήσαμε ποσοτική Real-Time PCR, η οποία έδειξε ότι τα γονίδια mecA, femA, femB και femX εκφράστηκαν στα ίδια επίπεδα σε όλα τα στελέχη. Επιπροσθέτως, εντοπίσαμε και στα τρία fem γονίδια αρκετές μεταλλάξεις που οδηγούν σε ουσιαστικές αντικαταστάσεις αμινοξέων σε θέσεις που ενδεχομένως να επηρεάζουν τη δραστηριότητα των Fem ενζύμων. Οι μεταλλάξεις στο γονίδιο femX ήταν περισσότερο συντηρημένες στα δύο OS-MRSA στελέχη που αναπτύχθηκαν και ήταν πλήρως λειτουργικά ευαίσθητα στην οξακιλλίνη με όλες τις δυνατές δοκιμασίες (χαρακτηριστικά αναπτύχθηκαν μόνο μέχρι 1 mg/L οξακιλλίνης στην πληθυσμιακή ανάλυση). Θεωρούμε ότι η συσσώρευση αυτών των αμινοξικών αλλαγών μπορεί να επηρεάσει την ανέπαφη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος, συμβάλλοντας στην μη αναμενόμενη ανταπόκριση αυτών των στελεχών στην οξακιλλίνη.Τέλος, συγκρίναμε in vitro την δραστικότητα της δικλοξακιλλίνης με εκείνη της βανκομυκίνης σε 15 κλινικά στελέχη OS-MRSA. Με πληθυσμιακές αναλύσεις, διαπιστώσαμε ότι 6 OS-MRSA στελέχη ήταν σε θέση να αναπτυχθούν παρουσία μέχρι και 8 mg/L δικλοξακιλλίνης, ενώ 9 στελέχη ήταν σε θέση να αναπτυχθούν σε 12 έως >32 mg/L δικλοξακιλλίνης. Όλα τα στελέχη ήταν πλήρως ευαίσθητα και αναπτύχθηκαν μέχρι 2 mg/L βανκομυκίνης. Και τα δύο φάρμακα όμως παρουσίασαν παρόμοιες βακτηριοκτόνες δραστηριότητες. Στις πειραματικές λοιμώξεις, η θεραπευτική αποτελεσματικότητα της δικλοξακιλλίνης (το εμπορικά διαθέσιμο σκεύασμα της οξακιλλίνης) σε 10 OS-MRSA στελέχη ήταν σημαντική [P<0.05 σε σχέση με μάρτυρες (control) χωρίς θεραπεία] ενώ η βανκομυκίνη ήταν αποτελεσματική (P<0.05) έναντι σε 12 OS-MRSA στελέχη. Παράλληλα, η δικλοξακιλλίνη είχε αποτελεσματικότητα η οποία ήταν συγκρίσιμη με εκείνη της βανκομυκίνης (P>0.05) σε 8 OS-MRSA στελέχη. Η ευνοϊκή ανταπόκριση στη θεραπεία με δικλοξακιλλίνη μπορεί να υποδηλώνει ότι αντισταφυλοκοκκικές πενικιλλίνες θα μπορούσαν πιθανώς να χρησιμοποιηθούν σε OS-MRSA λοιμώξεις.