Ανάπτυξη της μεθόδου SSCP και εφαρμογή στην ταυτοποίηση σημειακών μεταλλάξεων στη β-μεσογειακή αναιμία και άλλα γενετικά νοσήματα

Abstract

Beta-thalassaemia is a single gene genetic disorder which is inherited in an autosomal recessive manner. The clinical symptoms of beta-thalassaemia vary in severity. The disorder is characterized by the complete lack or the reduced production of hemoglobin A β-chains, because of mutations in the β-globin gene. For the prenatal diagnosis of beta-thalassaemia, detection of carriers and the correlation of genotype to phenotype, detection and identification is required.Among the various methods used for the detection of mutations Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP), is one of the simplest and most sensitive. The object of the present study was to establish the method of SSCP in the Laboratory of Biochemistry of the Medical school of the University of Thessaly and to investigate whether can be employed for the identification and not simply the detection of the four commonest mutations beta-thalassaemic mutations in the Greek population. The method was also used for the identification of ΔF508 mutation of Cystic Fibrosis, another genetic disease. Genomic DNA was extracted from forty beta-thalassaemic patients and a 238bp fragment of the β-globin gene was amplified by PCR, which contains the mutations under investigation (IVS-I-1, IVS-I-6, IVS-I-110 και cd39), which account 80% of the total mutations present in the Greek population. After the conditions of the SSCP method were optimized, we analyzed the PCR products by polyacrylamide gel electrophoresis, under non denaturing conditions, and the bands were visualized by silver nitrate. We found that single stranded DNA gave a reproducible separation pattern, specific for the combination of mutations present. With the use of control beta-thalassaemic samples, containing six out of ten possible different combinations of the four mutations under investigation, we were able to predict the mutations present in a quarter of our samples and we verified the SSCP predictions by the method of ARMS, a direct method for mutation identification. We conclude that this non-radioactive PCR-SSCP method can be reliably used for the identification of beta-thalassaemic mutations, provided suitable controls are available. Moreover, the method is easy to apply for mutation detection in carriers making it particularly useful in population screening. Finally, we also showed that the method of SSCP can be employed for the identification of ΔF508 mutation of CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator) gene, among carriers and patients.

Η β-Μεσογειακή αναιμία είναι μία γενετική μονογονιδιακή ασθένεια που κληρονομείται με αυτοσωμικό υπολειπόμενο χαρακτήρα. Η κλινική εικόνα της β-Μεσογειακής αναιμίας ποικίλει σε βαρύτητα. Η ασθένεια χαρακτηρίζεται από έλλειψη ή μειωμένη σύνθεση της β-αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης Α και προκύπτει από μεταλλάξεις στο γονίδιο της β-σφαιρίνης. Για την προγεννητική διάγνωση της β-Μεσογειακής αναιμίας, την αποκάλυψη των φορέων και το συσχετισμό γονότυπου-φαινότυπου είναι απαραίτητη η δυνατότητα ανίχνευσης και ταυτοποίησης των μεταλλάξεων. Ανάμεσα στις διάφορες μεθόδους που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση μεταλλάξεων η SSCP (πολυμορφισμός διαμόρφωσης μονόκλωνου DNA) είναι μία από τις πλέον ευαίσθητες και απλές. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η ανάπτυξη της μεθόδου SSCP στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Ιατρικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας και η διερεύνηση της χρησιμότητάς της στην ταυτοποίηση, αντί απλά την ανίχνευση, των τεσσάρων συνηθέστερων μεταλλάξεων της β-Μεσογειακής Αναιμίας στον Ελληνικό πληθυσμό. Η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε επίσης για την ταυτοποίηση της συνηθέστερης μετάλλαξης της Κυστικής Ίνωσης, ενός άλλου μονογονιδιακού γενετικού νοσήματος. Απομονώθηκε DNA από σαράντα ασθενείς με β-Μεσογειακή αναιμία και πολλαπλασιάσθηκε με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης τμήμα 238 βάσεων του β-γονιδίου της σφαιρίνης το οποίο περιλαμβάνει τις τέσσερις μεταλλάξεις υπό εξέταση (IVS-I-1, IVS-I-6, IVS-I-110 και cd39) οι οποίες αντιστοιχούν στο 80% του συνόλου των μεταλλάξεων που παρατηρούνται στον ελληνικό πληθυσμό. Αφού βελτιστοποιήσαμε τις συνθήκες της μεθόδου SSCP αναλύσαμε τα προϊόντα της αντίδρασης PCR με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακριλαμιδίου κάτω από μη αποδιατακτικές συνθήκες και οι ζώνες έγιναν ορατές μετά από χρώση με νιτρικό άργυρο. Βρήκαμε ότι τα μονόκλωνα DNA έδωσαν ένα επαναλήψιμο πρότυπο διαχωρισμού χαρακτηριστικό του συνδυασμού των μεταλλάξεων που φέρουν. Με τη χρήση δειγμάτων μαρτύρων που έχουν έξι από τους δέκα δυνατούς συνδυασμούς των τεσσάρων συνηθέστερων μεταλλάξεων, μπορέσαμε να προβλέψουμε τις μεταλλάξεις που υπάρχουν σε ένα τέταρτο του δείγματός μας και επιβεβαιώσαμε τις προβλέψεις μας με μία άμεση μέθοδο προσδιορισμού των μεταλλάξεων, την μέθοδο ARMS. Συμπεραίνουμε ότι η μη ραδιενεργή μέθοδος της PCR-SSCP μπορεί να εφαρμοσθεί για την ταυτοποίηση μεταλλάξεων της β-ΜΑ, εφόσον κατάλληλα δείγματα μαρτύρων είναι διαθέσιμα. Επιπλέον η μέθοδος εφαρμόζεται εύκολα σε ετεροζυγώτες, καθιστώντας την ιδιαίτερα χρήσιμη για πληθυσμιακό έλεγχο φορέων.Τέλος δείξαμε ότι η μέθοδος SSCP μπορεί να εφαρμοσθεί για την ταυτοποίηση της συνηθέστερης μετάλλαξης (ΔF508) του γονιδίου της CFTR (διαμεμβρανικός ρυθμιστής της κυστικής ίνωσης), ανάμεσα σε φορείς και πάσχοντες από Κυστική Ίνωση.