Γενετική, μοριακή και φυλογενετική μελέτη του μιτοχονδριακού DNA του Silurus glanis (Siluriformes, Siluridae)

Abstract

The mitochondrial DNA (mtDNA) is a double-stranded circular DNA molecule ranging from 16 to 18 kb in length in animals. In higher vertebrates it consists of 37 genes with few intergenic spacers and one non-coding region the control region. Furthermore, the maternal inheritance, the almost absence of recombination, and the high substitution rate, make this molecule attractive for phylogenetic studies. The order Siluriformes (catfishes) consists of many species (primarily freshwater fishes) and constitutes a monophyletic group with the interrelationships of its families to remain not fully resolved. The European catfish (Silurus glanis) is the largest freshwater fish in Europe, with an extended natural distribution and great commercial importance. Few studies exist on S. glanis populations and little is known concerning its nuclear and mitochondrial genomes. In the present study, the complete mitochondrial genome of S. glanis, the first of the Siluridae family, is reported. Cloning and sequence analysis of the entire S. glanis mtDNA were performed. An analysis investigating the possible genetic variability of the S. glanis population in Orestiada lake of Kastoria was also performed along with an extension of a previous study of the so far reported Siluriformes D-loop sequences. Furthermore, we explored the evolutionary relationships of S. glanis to its relatives using all available siluriform complete mitogenomes and we investigated the phylogenetic utility of 16S rRNA by inferring a family-level topology using a fully-comprehensive dataset of 337 16S rRNA sequences. The complete sequence of S. glanis mitochondrial genome has a length of 16526 base pairs, bearing no introns. It codes for 13 protein-coding genes, 22 tRNA genes, 2 rRNA genes, and one major non-coding region (887 bp long). All S. glanis mitochondrial genes and the non-coding region have a comparable size and are organized in the same order and direction with the great majority of reported mtDNAs. Based on the fact that D-loop is the most variable region of mtDNA we used this region to examine the genetic diversity of S. glanis population in the Orestiada lake. The results showed that the Kastoria lake S. glanis population exhibit very low levels of genetic diversity (1 polymorphism in a total of 615 nucleotide positions). This finding comes in agreement with previously reported results. Additionally, in order to extend the results from a previous study, a comparative analysis of the Siluriformes D-loop region (sequences from 12 families), was performed and revealed several important regulatory elements (TAS, ETAS, CSBs and OH-like). Furthermore, phylogenetic investigations were performed based on all seven available siluriform complete mitochondrial genomes using all mitogenomes sequences or parts of them (12 protein-coding genes, rRNA genes tRNAs genes). This analysis revealed fully resolved phylogenetic trees using the concatenated nucleotide sequences of the 12 protein-coding genes. In this dataset, Bayesian, maximum parsimony and maximum likelihood analysis provided solid evidence for tight genealogical connections between southeast Asian taxa and North American freshwater ichthyofauna (Ictaluridae). Finally, Bayesian phylogenetic reconstruction of the most extended so far 16S rRNA dataset in Siluriformes (337 taxa, 29 families) was attempted. This analysis also performed an evaluation of the utility of 16S rRNA gene, which revealed a decay in phylogenetic signal at some hierarchical taxonomic level. The Bayesian topology recovered certain families monophyletic and detected other families as problematic. This extensive analysis can be considered as a starting point for more thorough examinations and analytical treatments involving refinements in alignment strategies, choice of additional markers, and combined approaches.

Το mtDNA είναι ένα κυκλικό δίκλωνο μόριο που έχει μήκος 16-18 Kb σε όλα τα ζώα. Στα ανώτερα σπονδυλωτά περιλαμβάνει 37 γονίδια στενά συνδεδεμένα μεταξύ τους και μια μη κωδικοποιούσα περιοχή ελέγχου. Παρουσιάζει μητρική κληρονόμηση, απουσία ανασυνδυασμού και υψηλό ρυθμό αντικαταστάσεων βάσεων αποτελώντας ένα ελκυστικό μόριο για φυλογενετικές αναλύσεις. Η τάξη Siluriformes (γατόψαρα) αποτελείται από μεγάλο αριθμό ειδών (κυρίως γλυκών νερών), Αποτελεί μονοφυλετική ομάδα αλλά οι σχέσεις μεταξύ των οικογενειών της τάξης παραμένουν σε πολλά σημεία αδιευκρίνιστες. Ο γουλιανός (S. glanis) αποτελεί το μεγαλύτερο είδος της τάξης Siluriformes που ζει στην Ευρώπη, με ευρεία εξάπλωση και σημαντική εμπορική αξία. Λίγες μελέτες μέχρι σήμερα αφορούν τους πληθυσμούς του και παραμένουν άγνωστα αρκετά στοιχεία για το πυρηνικό και μιτοχονδριακό του γονιδίωμα. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, πραγματοποιήθηκε αλληλούχηση και λεπτομερής ανάλυση ολόκληρου του mtDNA του γουλιανού, αναλύθηκε ο πληθυσμός του στη λίμνη Ορεστιάδα της Καστοριάς όσον αφορά στη γενετική του ποικιλότητα, ενώ επεκτάθηκε προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου σχετικά με τη δομή της περιοχής ελέγχου των ειδών της τάξης Siluriformes. Επίσης, πραγματοποιήθηκε φυλογενετική διερεύνηση στο επίπεδο της τάξης τόσο με βάση τις αλληλουχίες των 6 πλήρων mtDNAs, που είναι ήδη κατατεθιμένα στις διεθνείς βάσεις δεδομένων όσο και με βάση όλες τις διαθέσιμες αλληλουχίες 16S rRNA (337 αλληλουχίες). Το μιτοχονδριακό γονιδίωμα του S. glanis έχει μήκος 16526 bp και δε διαθέτει ιντρόνια. Περιλαμβάνει 13 γονίδια που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες, 22 γονίδια tRNAs, 2 γονίδια rRNAs και μία μεγάλη μη κωδικοποιούσα περιοχή (D-loop) με μήκος 887 bp. Όλα τα γονίδια καθώς και η D-loop παρουσιάζουν παρόμοιο μέγεθος και είναι οργανωμένα με τη ίδια σειρά και κατεύθυνση όπως στα περισσότερα μιτοχονδριακά γονιδιώματα. Επειδή η D-loop αποτελεί τη λιγότερο συντηρημένη περιοχή του mtDNA, πραγματοποιήθηκαν δύο μελέτες που τη χρησιμοποίησαν ως εργαλείο. Η πρώτη αφορούσε τη διερεύνηση των επιπέδων γενετικής ποικιλότητας του πληθυσμού των γουλιανών στη λίμνη της Καστοριάς και αποκάλυψε ιδιαίτερα χαμηλά επίπεδα ενδοπληθυσμιακής ποικιλομορφίας (1 πολυμορφισμός σε 615 συνολικά νουκλεοτιδικές θέσεις), κάτι αναμενόμενο από τις μέχρι τώρα έρευνες. Η δεύτερη αφορούσε στην επέκταση προηγούμενης εργασίας σχετικά με τον καθορισμό της δομής της D-loop των ειδών της τάξης Siluriformes. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν οι D-loop από όλες τις διαθέσιμες οικογένειες (12 συνολικά) και προσδιορίστηκαν όλες οι συντηρημένες περιοχές με λειτουργικό ρόλο (αλληλουχίες TAS, ETAS, CSBs και OH-like). Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε φυλογενετική ανάλυση με τη χρήση όλων των διαθέσιμων ολοκληρωμένων μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων ειδών της τάξης Siluriformes. Στην ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν τόσο τα πλήρη mtDNAs όσο και τα τμήματα αυτών (12 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (νουκλεοτιδικές και αμινοξικές αλληλουχίες), αλληλουχίες rRNAs και tRNAs γονιδίων). Η ανάλυση αποκάλυψε ότι τα περισσότερο ανελυμένα και αξιόπιστα δέντρα προέκυπταν με τη χρήση των πλήρων mtDNAs και των αλληλουχιών των 12 πρωτεϊνικών γονιδίων. Στις αλληλουχίες αυτές εφαρμόστηκε ανάλυση κατά Bayes, μέγιστης φειδωλότητας και μέγιστης πιθανοφάνειας που αποκάλυψαν ενδιαφέροντα στοιχεία σχετικά με τη θέση της οικογένειας Ictaluridae και τις σχέσεις αυτής (ενδημική στη Βόρεια Αμερική) με άλλες οικογένειες που ενδημούν στη νοτιοανατολική Ασία. Τέλος, πραγματοποιήθηκε η μεγαλύτερη μέχρι σήμερα φυλογενετική διερεύνηση στο επίπεδο της τάξης με τη χρήση όλων των διαθέσιμων αλληλουχιών 16S rRNA γονιδίων (337 αλληλουχίες, 29 οικογένειες) εφαρμόζοντας τη μέθοδο Bayes. Στο πλαίσιο της ανάλυσης, πραγματοποιήθηκε μια εκτίμηση της χρήσης του 16S rRNA στις εξελικτικές μελέτες, που αποκάλυψε ότι το φυλογενετικό σήμα που παρουσιάζει φαίνεται να χάνεται πάνω από κάποιο ταξονομικό επίπεδο. Η τοπολογία που προέκυψε απέδωσε αρκετές οικογένειες ως μονοφυλετικές, ενώ άλλες εμφάνισαν φαινόμενα παραφυλίας επιβεβαιώνοντας σε κάποιες περιπτώσεις προηγούμενες μελέτες. Αυτή η μεγάλη σε αριθμό δειγμάτων έρευνα μπορεί να αποτελέσει ένα πρώτο βήμα για περισσότερο διεξοδικές αναλύσεις, ενώ μπορεί να χρησιμεύσει και στην εκτίμηση των στρατηγικών που χρησιμοποιούνται στην κατασκευή των αρχείων δεδομένων, όπως είναι οι στρατηγικές ευθυγράμμισης, η επιλογή των μοριακών δεικτών κ.α.