Μελέτη συγγενών και παθογόνων αιτιών εμβρυϊκού θανάτου με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) και της ανοσοϊστοχημείας

Abstract

The aim of this research was the study of congenital and pathogenic causes of fetal death, which was estimated at 14,4%. The abortional material, which derived from the region of Thrace, was consisted of 259 fetuses from 10th to 38th week of gestation and concerned the period 2003-2011. The separation of the fetuses into five categories of obvious pathology, was made after the histopathological examination and under information of ultrasound examination, in order to study the causes that provoked them and hence the intrauterine death, by applying the methods of Polymerase Chain Reaction (PCR) and Immunohistochemistry (IHC). In the category of Neural Tube Defects (NTDs), that was 6% of all concerned embryos, the expression of the protein Shh was studied immunohictochemically. Total deregulation was found in the tissues of the pathological embryos compared with the control group, with statistically significant differences per tissue. In the category of the inflammation of placenta, chorioamnionitis was studied as a cause of fetal death and was detected in 55%. The apoptotic factors Caspase 8, Caspase 9 and M30, and the inflammatory factors TNF-a and IL1-a, were applied in sections of placenta and membranes, respectively. The expression of the apoptotic factors was linearly increased with detection 56,3%, 67,4% and 76,1% in the groups of inflammation 1 to 3 (p=0,045) and total detection 69,0%, compared to the control group, where the positive expression was 56,7%, difference not reached the limits of statistical significance (p=0,193, OR=1,7, 95%). Similarly, from the markers of inflammation, where eventually only TNF-a was identified, the expression was also linear with 56,3%, 58,7% and 73,1% in groups 1 to 3, respectively. The overall positive expression was 64,8%, compared to the control group, which was 20%, a statistically significant difference (P<0,001, OR=7,4, 95%). In the category Dropsy-Hydrocephalus-Total Edema, that also included 6% of the concerned embryos, the presence of infection with B19, which can cause hydrops fetalis, was examined by PCR and Immunohistochemistry. B19 was detected in one fetus immunohistochemically, giving advantage to the method, for application in paraffin tissue. The detection of infection agents, held in the fourth category, with the application of PCR, touched 1,54% in the aborted fetuses and 1% in the control group, and did not give statistically significant results (p=0,701>0,05). While, there was not a statistically significant difference in the detection of each agent in the aborted fetuses, compared to the control group: p for CMV=0,720>0,05, p for Β19=1,000>0,05, p for Mycoplasma hominis=1,000>0,05 and p for Chlamydia trachomatis= 0,436>0,05. The 23% of all cases that was counted in the 5th category, were fetuses with congenital and chromosomal abnormalities that unexceptionally caused the intrauterine death, but the conduct of results, was not possible with the used techniques, because of their defects. In the remaining 8% the abortional factor was unclear. From our results we concluded that: a) deregulation of shh gene and the other signaling molecules that cooperate with it, can cause the defects of NTDs, leading to fetal death, b) Chorioamnionitis as a mechanism, triggers apoptosis. Both processes so interconnected, cause the secretion of their factors linearly, depending on the severity of inflammation, causing damage to the fetus, which may lead to death, c) the infection agents are detected in the region of Thrace at low rates without a clear role in fetal death, d) in the laboratory research, using paraffin tissue as primary material, for the most reliable results, the right choice of experimental technique or combination thereof, should be made. We believe that, the increased rate of fetal death, in the regions of Evros and Thrace, should alert the population and the scientific community. The factors that affect the intrauterine growth of fetus leading to the outcome may be prevented and treated successfully, by the continuous progress of laboratory techniques of Molecular Biology and Medicine.

Σκοπός της παρούσας έρευνας, ήταν η μελέτη των συγγενών και παθογόνων αιτιών πρόκλησης εμβρυϊκού θανάτου, το ποσοστό του οποίου υπολογίστηκε στο 14,4%. Το υλικό αποβολών προήλθε από την περιοχή της Θράκης και περιελάμβανε 259 έμβρυα, από τη 10η έως και την 38η εβδομάδα κύησης και αφορούσε στη χρονική περίοδο 2003-2011. Ο διαχωρισμός των εμβρύων σε πέντε κατηγορίες προφανούς παθολογίας, έγινε μετά την ιστοπαθολογική εξέτασή τους και βάσει πληροφοριών του υπερηχογραφικού ελέγχου, με σκοπό την επακόλουθη μελέτη τους, για την ανίχνευση των αιτιών πρόκλησής τους και άρα του ενδομήτριου θανάτου, με την εφαρμογή των μεθόδων της Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης (PCR) και της Ανοσοϊστοχημείας (IHC). Στην κατηγορία των Δυσπλασιών του Νευρικού Σωλήνα (NTDs), που αποτέλεσε το 6% του συνόλου των εξεταζόμενων εμβρύων, μελετήθηκε η έκφραση της πρωτεΐνης Shh, όπου διαπιστώθηκε ανοσοϊστοχημικά, καθολική απορύθμισή της, στους ιστούς των παθολογικών εμβρύων, εν συγκρίσει με την ομάδα ελέγχου, με στατιστικά σημαντικές διαφορές ανά ιστό. Στην κατηγορία των φλεγμονών του πλακούντα, μελετήθηκε η χοριοαμνιονίτιδα ως αίτιο πρόκλησης του ενδομήτριου θανάτου και εντοπίστηκε σε ποσοστό 55%. Εφαρμόστηκαν οι αποπτωτικοί παράγοντες Caspase 8, Caspase 9, και M30 και οι παράγοντες φλεγμονής TNF-a και IL- 1a σε τομές πλακούντα και υμένα αντίστοιχα. Στους δείκτες απόπτωσης, η έκφραση ήταν γραμμικά αυξανόμενη με εντοπισμό 56,3%, 67,4% και 76,1% στις ομάδες φλεγμονής 1 έως 3, (p για γραμμική σχέση=0,045) και συνολικό εντοπισμό 69,0% έναντι της ομάδας ελέγχου, όπου η θετική έκφραση ήταν 56,7%, διαφορά που δεν έφτασε στα όρια της στατιστικής σημαντικότητας (p=0,193, OR=1,7, 95% ΔΕ=0,8 έως 3,8). Αντίστοιχα, από τους δείκτες φλεγμονής, όπου τελικά εντοπίστηκε μόνο ο TNF-a, η έκφραση ήταν επίσης γραμμική με 56,3%, 58,7% και 73,1% στις ομάδες 1, 2 και 3, αντίστοιχα (p για γραμμική σχέση=0,037). Η συνολική θετική έκφραση ήταν 64,8% έναντι της ομάδας ελέγχου, όπου ήταν 20%, διαφορά στατιστικά σημαντική (P<0,001, OR=7,4, 95% ΔΕ=2,8 έως 19,2). Στην κατηγορία Υδρωπικία-Υδροκεφαλία-Καθολικό οίδημα που περιελάμβανε επίσης 6% των εμβρύων, εξετάστηκε με PCR και ανοσοϊστοχημεία, η ύπαρξη λοίμωξης από τον ιό Β19, που προκαλεί τον εμβρυϊκό ύδρωπα και εντοπίστηκε ανοσοϊστοχημικά σε ένα έμβρυο, δίνοντας προτέρημα στη μέθοδο για εφαρμογή σε ιστό παραφίνης. Ο εντοπισμός λοιμωδών παραγόντων, που πραγματοποιήθηκε στην 4η κατηγορία με την εφαρμογή της PCR και άγγιξε το 1,54% στα αποβληθέντα έμβρυα και το 1% στην ομάδα ελέγχου, δεν έδωσε στατιστικά σημαντικά αποτελέσματα (p=0,701>0,05). Ενώ δεν ήταν στατιστικά σημαντική και η διαφορά εντοπισμού του καθενός από αυτούς, στα αποβληθέντα έμβρυα εν συγκρίσει με τη ομάδα ελέγχου, με p για CMV=0,720>0,05, p για Β19=1,000>0,05, p για Mycoplasma hominis=1,000>0,05 και p για Chlamydia trachomatis= 0,436>0,05. Το 23% του συνόλου των περιστατικών, που συμπεριλήφθηκε στην 5η κατηγορία, αποτέλεσαν έμβρυα με συγγενείς και χρωμοσωμικές ανωμαλίες που αδιαμφισβήτητα προκάλεσαν τον ενδομήτριο θάνατο τους, όμως λόγω της φύσης τους, δεν ήταν εφικτή διεξαγωγή αποτελεσμάτων με τις εφαρμοζόμενες τεχνικές. Στο υπόλοιπο 8% η αιτία του ενδομήτριου θανάτου ήταν αδιευκρίνιστη. Από τα αποτελέσματά μας συμπεράναμε ότι: α) η απορύθμιση του γονιδίου shh καθώς και οι των άλλων σηματοδοτικών μορίων που συνεργάζονται με αυτό, προκαλούν τις δυσμορφίες των NTDs, οδηγώντας σε ενδομήτριο θάνατο, β) η χοριοαμνιονίτιδα ως μηχανισμός, πυροδοτεί την απόπτωση και οι δύο διαδικασίες, με τρόπο αλληλένδετο, προκαλούν γραμμική έκκριση των παραγόντων τους, ανάλογα με τη σοβαρότητα της φλεγμονής, προκαλώντας βλάβες στο έμβρυο που μπορεί να οδηγήσουν στην κατάληξή του, γ) οι λοιμώδεις παράγοντες, ανιχνεύονται στην περιοχή της Θράκης σε χαμηλά ποσοστά, χωρίς ξεκάθαρο ρόλο στην πρόκληση του εμβρυϊκού θανάτου, δ) κατά την εργαστηριακή έρευνα με πρωταρχικό υλικό, ιστό παραφίνης, πρέπει να γίνεται σωστή επιλογή της πειραματικής τεχνικής ή και συνδυασμός τους, για την πιο αξιόπιστη εξαγωγή αποτελεσμάτων. Πιστεύουμε ότι το αυξημένο ποσοστό του ενδομήτριου θανάτου στην περιοχή του Έβρου και την ευρύτερη περιοχή της Θράκης, πρέπει να ευαισθητοποιήσει τον πληθυσμό και την επιστημονική κοινότητα, καθώς με τη συνεχή πρόοδο των εργαστηριακών τεχνικών της Μοριακής Βιολογίας και της Ιατρικής, οι παράγοντες που επηρεάζουν την ενδομήτρια ανάπτυξη του εμβρύου και οδηγούν στην κατάληξη του, δύναται να προληφθούν και να αντιμετωπιστούν με επιτυχία.