Μελέτη της έκφρασης του υποδοχέα Notch και των συνδετών του στον καρκίνο του μαστού

Abstract

Notch signalling pathway is an evolutionary conserved pathway that plays a central role in stem cell biology, tumorigenesis, angiogenesis, cell differentiation, proliferation and apoptosis. Although Notch receptors and ligands are known to be involved in mammary tumorigenesis, more evidence is still required in order to fully clarify their role in different breast cancer subtypes. The aim of this experimental study was to assess the gene expression of notch receptors (notch1-4) and ligands (jag1, 2, dll1 and 2) in breast cancer subgroups according to ERα, PR and HER2 status. Το correlate the level of notch receptors' and ligands' expression with breast cancer pathology and vegf gene expression as a marker of angiogenesis. Moreover, in this study we explored the expression of genes involved in notch signaling in triple negative breast cancer patients. 200 primary breast cancer specimens were examined. We analyzed the mRNA expression levels of Notch receptors and ligands with Real Time PCR. β-actin was used as a reference housekeeping gene. The expression of genes that are targets of notch signaling was examined in 24 triple negative breast cancer samples by means of microarray profiling (GEArray Gene Expression Arrays). Notch receptors and ligands are differentially expressed in breast cancer subgroups, according to ER, PR and HER2 status. More specifically, we found that ERα negative and triple negative breast cancer samples express statistically significant higher levels of notch3 and notch1 mRNA, while the ERα positive and HR+/HER2- tumors overexpress notch4, jag1, dll1 and dll4. We didn’t notice any effect of hormone receptor and HER2 status on gene expression of notch2 and jag2, although notch2 expression was particularly high. The grade and tumor size seem to be correlated with gene expression of notch receptors and ligands. Well-differentiated tumors (grade 1 and 2) were found to exhibit increased levels of notch4 and dll1 at statistically significant levels. Tumors smaller than 20 mm in diameter overexpressed notch4, jag1 and dll1 compared with those having size larger than 20 mm, which overexpressed notch3. Triple negative breast tumors overexpress vegf at statistical significant levels. We found a moderate positive correlation between vegf and dll4 gene expression in all subgroups except that of triple negative tumors. In triple negative tumors we found a moderate positive correlation between the mRNA levels of vegf and egfr. It is likely that in hormone receptor positive breast tumors angiogenesis is regulated by notch signaling, while in triple negative breast cancers, the egfr pathway seems to be the coordinator of this process. We found triple negative breast cancer samples to express transcription factors that are target genes of notch signaling. Considering this, we conclude that the notch signaling pathway is activated in triple negative breast tumors. Finally, the notch signaling pathway plays a central role in breast cancer. The notch pathway might be an attractive target for therapeutic treatment of breast cancer, although one should be very careful in choosing the most appropriate therapeutic anti-notch target-molecule in regards with the patient target subgroup that could be profited the most.

Το σηματοδοτικό μονοπάτι Notch αποτελεί ένα εξελικτικά συντηρημένο σηματοδοτικό μονοπάτι που διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη βιολογία των βλαστικών κυττάρων, στην καρκινογένεση, στην αγγειογένεση, στην κυτταρική διαφοροποίηση, στον πολλαπλασιασμό και στην απόπτωση. Παρά το γεγονός ότι είναι γνωστή η εμπλοκή του στην ογκογένεση του μαζικού αδένα απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να αποσαφηνιστεί πλήρως ο ρόλος του στους διάφορες υποομάδες καρκίνου του μαστού. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να μελετηθεί η γονιδιακή έκφραση των υποδοχέων Notch (Notch 1-4 και των συνδετών τους (JAG1, 2 και Delta 1, 4) στις διάφορες υποομάδες καρκίνου του μαστού, με βάση την έκφραση των οιστρογονικών (ERα), προγεστερονικών (PR) και Her2 υποδοχέων. Να γίνει συσχέτιση με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των όγκων και με τη γονιδιακή έκφραση του VEGF ως δείκτη αγγειογένεσης. Επιπλέον στόχος ήταν να μελετηθεί η έκφραση γονιδίων που αποτελούν στόχους του ενεργοποημένου σηματοδοτικού μονοπατιού Notch στους τριπλά αρνητικούς όγκους μαστού. Υλικό τής παρούσας μελέτης αποτέλεσαν 200 δείγματα ασθενών με πρωτοπαθή καρκίνο του μαστού. Ο έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης έγινε σε επίπεδο mRNA με τη βοήθεια της μεθόδου Real Τime PCR και με γονίδιο αναφοράς τη β-ακτίνη. Στα 24 τριπλά αρνητικά δείγματα καρκίνου μαστού η έκφραση των γονιδίων που ελέγχονται από το ενεργοποιημένο σηματοδοτικό μονοπατιού Notch μελετήθηκε και με τη μέθοδο των μικροσυστοιχιών (Oligo GE arrays).Η έκφραση των notch υποδοχέων και συνδετών διαφοροποιείται στα δείγματα καρκίνου του μαστού όπως αυτά ομαδοποιήθηκαν με βάση την παρουσία των ERα, PR και Her2 υποδοχέων. Πιο συγκεκριμένα, οι ERα αρνητικοί και τριπλά αρνητικοί όγκοι μαστού εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα notch3 και notch1 mRNA σε στατιστικώς σημαντικά επίπεδα, ενώ οι ERα θετικοί και HR+/HER2- όγκοι μαστού υπερεκφράζουν notch4, jag1, dll1 και dll4. Η γονιδιακή έκφραση του notch2 είναι ιδιαίτερα αυξημένη και, όπως και η έκφραση του jag2, δεν επηρεάζεται από την παρουσία ή μη ορμονικών και Her2 υποδοχέων. O βαθμός διαφοροποίησης και το μέγεθος του όγκου φαίνεται να συσχετίζονται με τη γονιδιακή έκφραση των notch γονιδίων και συνδετών. Ειδικότερα, οι καλής διαφοροποίησης όγκοι (grade 1 και 2) εκφράζουν αυξημένα επίπεδα notch4 και dll1 σε στατιστικώς σημαντικά επίπεδα. Οι όγκοι διαμέτρου μικρότερης των 20mm υπερεκφράζουν notch4, jag1 και dll1, σε αντίθεση τους όγκους διαμέτρου μεγαλύτερης των 20 mm που υπερεκφράζουν notch3. Το γονίδιο του vegf βρέθηκε να υπερεκφράζεται στην ομάδα των τριπλά αρνητικών όγκων μαστού. Η γονιδιακή έκφραση του vegf συσχετίζεται μέτρια θετικά με τη γονιδιακή έκφραση του dll4, σε όλες τις υποκατηγορίες καρκίνου του μαστού εκτός από αυτή με τριπλά αρνητικό φαινότυπο. Σε αυτή την κατηγορία συσχετίζεται μέτρια θετικά με τη γονιδιακή έκφραση του egfr, σε στατιστικώς σημαντικά επίπεδα. Φαίνεται λοιπόν ότι στους ορμονοεξαρτώμενους όγκους, η αγγειογένεση ρυθμίζεται κυρίως μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού notch, ενώ στους τριπλά αρνητικούς όγκους, αν και χαρακτηρίζονται από υπερέκφραση του vegf, φαίνεται πρωταγωνιστικό ρόλο να αναλαμβάνει το μονοπάτι του egfr.Στα τριπλά αρνητικά δείγματα μαστού παρατηρήθηκε γονιδιακή έκφραση μεταγραφικών παραγόντων που αποτελούν γονίδια στόχους του ενεργοποιημένου σηματοδοτικού μονοπατιού notch. Συνεπώς το σηματοδοτικό μονοπάτι notch είναι ενεργοποιημένο στους τριπλά αρνητικούς όγκους μαστού. Συμπερασματικά, το σηματοδοτικό μονοπάτι Νotch φαίνεται να παίζει κεντρικό ρόλο στον καρκίνο του μαστού. Συνεπώς θα μπορούσε στο μέλλον να αποτελέσει ελκυστικό θεραπευτικό στόχο. Θα πρέπει ωστόσο να γίνει προσεχτική επιλογή τόσο του θεραπευτικού “anti-Notch” μορίου-στόχου, όσο και της πληθυσμιακής υποομάδας-στόχου καρκίνου του μαστού που πιθανόν θα ωφεληθεί