Μελέτη της προστατευτικής δράσης της αντιθρομβίνης ΙΙΙ στην καρδιά και στους πνεύμονες στο σύνδρομο οξείας ισχαιμίας - επαναιμάτωσης των οπισθίων άκρων: πειραματική μελέτη σε επίμυες

Abstract

Introduction: Acute ischemia-reperfusion of a lower limb could cause injury to distal organs (remote ischemia-reperfusion) and systematic inflammation response resulting in high mortality rates. Lipid hyperoxidation, caused by oxygen-free radicals released in the systematic circulation after the reperfusion, has been predicted as the major factor of the systematic response. Tissue levels of Malondialdehyde (MDA), which is one of the end products of the lipid hyperoxidation, has been used to measure indirectly the levels of oxygen-free radicals. Antithrombin III (AT III) is a single-chain glycoprotein which is produced by the liver and besides its coagulation role has also been shown to have marked anti-inflammatory effects and a half-life of 2-3 days. Purpose: The study of AT III as a protective factor against lung and myocardial injury after acute ischemia and reperfusion of the lower limb. Materials and Methods: 80 Wistar rats, weighing 250-300 gr, had been studied. Ischemia was produced by the application of a 0' Prolene suture ligature on the right hind limb. Ischemia was confirmed by Doppler and, in some cases, by arteriography. Animals were divided into those receiving AT III (dose 250mg/kg, Kybernin P; Aventis Behring GmbH) 30 minutes before the reperfusion (group A, n=30), and those receiving placebo (group B, n=30). Animals were then sacrificed. Blood samples for white blood cell (WBC) count, platelets (PLT), SGOT, SGPT, ALP and γ-GT taken from the vena cava and lung and myocardial tissue samples were taken at baseline, 30 minutes, and 4 hours after reperfusion for tissue MDA levels and light microscopy. Results: Increased WBC levels had been found in both groups after reperfusion, but no significant changes had been observed between the two groups. In the AT III group, SGOT levels were significant lower at 4 hours after reperfusion. No noticeable changes had been found between the two groups with regard to the biochemistry parameters tested (SGPT, ALP, γ-GT). In the lung tissue, MDA levels were significantly lower in the AT III group compared to the placebo group at baseline (p=0.001) and at 30 minutes (p=0.02) post reperfusion, but not at 4 hours (p=0.9). In total, MDA levels were found significantly reduced in the AT III group compared to placebo (p=0.005). In addition, significantly decreased MDA levels had been identified in the AT III group at baseline (zero time) post-reperfusion when compared to a sham group, i.e. those animals receiving AT III without ischemia-reperfusion (p=0.002).Optical microscopy of the tissue samples did not identify any significant differences between the two groups. Light microscopy examination with electron microscope revealed decreased damage in cell level for the AT III group. In the cardiac tissue, the AT III group, as a total, was found to have significantly lower MDA levels compared with the placebo group (p= 0.005). However, no statistically significant differences existed between the two groups at zero reperfusion time (p=0.07), 30 minutes (p=0.07) and 4 hours (p=0.2). Using light microscopy, sarcomeria disruption, intercellular oedema and free microfibers had all been found at 4 hours after reperfusion in the placebo group, but not in the AT III group. In addition, the intracellular oedema, which was found in the placebo group at baseline, was not noted in the AT III group. Optical microscopy did not reveal any noticeable changes between the two groups. Conclusions: Pretreatment with AT III 30 minutes before the reperfusion of an acutely ischemic limb can reduce the oxidant stress to lung and, less so, to myocardial tissue due to its anti-inflammatory and antioxidant action.

Εισαγωγή : Η επαναιμάτωση των κάτω άκρων μετά από οξεία ισχαιμία μπορεί να προκαλέσει βλάβες σε απομακρυσμένα όργανα και συστηματική φλεγμονώδη αντίδραση που σχετίζεται με υψηλή ποσοστά θνητότητας. Αυτό οφείλεται στις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου που εισέρχονται στην συστηματική κυκλοφορία και προκαλούν την λιπιδική υπεροξείδωση. Ένα από τα τελικά προϊόντα της λιπιδικής υπεροξείδωσης είναι η μαλονική διαλδεΰδη της οποίας η μέτρηση προσδιορίζει τις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου. H AT III είναι μια γλυκοπρωτεΐνη μονής αλύσου που συντίθεται στο ήπαρ και έχει ημιπερίοδο ζωής 2-3 ημέρες. Επίσης έχει αντιπηκτική και αντιφλεγμονώδη δράση. Σκοπός: H μελέτη της προστατευτικής δράσης της ΑΤ ΙΙΙ στους πνεύμονες και το μυοκάρδιο μετά από οξεία ισχαιμία κατά επαναιμάτωση των κάτω άκρων, ως ουσία με αντιφλεγμονώδεις και αντιπηκτικές ιδιότητες. Υλικό και Μέθοδοι: Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 80 επίμυες της φυλής Wistar βάρους 250-300γρ. στους 60 από τους οποίους εφαρμόστηκε ίσχαιμη περίδεση του σκέλους για 6 ώρες. 30 λεπτά πριν από την άρση της ισχαιμίας στους 30 χορηγήθηκε ΑΤ ΙΙΙ (ομάδα Α) σε δόση 250μγ/χγρ ΒΣ και στους άλλους μισούς φυσιολογικός ορός (ομάδα Β). Ακολούθως οι δύο υποομάδες χωρίστηκαν σε 3 υποομάδες ανάλογα με τον χρόνο της θυσίας που ήταν άμεσα μετά την επαναιμάτωση (Α1, Β1), σε 30 λεπτά (Α2, Β2) και στις 4 ώρες (Α3, Β3). Στους 20 επίμυες που χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα ελέγχου και δεν υποβλήθηκαν σε Ι-Ε χορηγήθηκε στους 10 ΑΤ ΙΙΙ (ομάδα Γ1) και στους 10 φυσιολογικός ορός (ομάδα Γ2). Ακολούθως υποβλήθηκαν σε θυσία. Από την κάτω κοίλη φλέβα λήφθηκαν δείγματα αίματος για εργαστηριακό έλεγχο των λευκών αιμοσφαιρίων, των αιμοπεταλίων, της SGOT, της SGPT, της ALP, και της γ-GT. Στην συνέχεια αφαιρέθηκαν οι πνεύμονες και η καρδία που εστάλθηκαν για έλεγχο της MDA και για μικροσκόπηση στο οπτικό και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διερχόμενης δέσμης. Αποτελέσματα: Τα λευκά αιμοσφαίρια αυξήθηκαν και στις δύο ομάδες μετά την επαναιμάτωση, αλλά δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές ανάμεσα στις δύο ομάδες. Στην ομάδα που έλαβε ΑΤ ΙΙΙ υπήρξε μια πτωτική τάση στην SGOT που γίνεται σημαντική στις 4 ώρες. Από τις υπόλοιπες παραμέτρους (SGPT, ALP, γ-GT) δεν παρατηρήθηκε αξιόλογη διαφορά ανάμεσα στις 2 ομάδες. Στον πνευμονικό ιστό βρέθηκαν σημαντικά ελαττωμένες τιμές MDA (p=0.001) στην ομάδα που έλαβε AT III σε σύγκριση με την ομάδα που έλαβε εικονικό φάρμακο σε χρόνο μηδέν (Α1, Β1) και μισή ώρα (p=0.02) μετά την επαναιμάτωση (Α2, Β2), με εξίσωση των τιμών στις 4 ώρες (p=0.9). Συνολικά η ομάδα Α (ΑΤ ΙΙΙ) βρέθηκε να έχει στατιστικά σημαντικά χαμηλότερες τιμές σε σχέση με την ομάδα που έλαβε φυσιολογικό ορό (p=0.005). Ένα άλλο στοιχείο που προέκυψε ήταν οι ελαττωμένες τιμές της MDA στην ομάδα που έλαβε ΑΤ ΙΙΙ μισή ώρα πριν από την επαναιμάτωση και θυσιάστηκαν σε χρόνο μηδέν σε σχέση με τους μάρτυρες που δεν υποβλήθηκαν σε ΙΕ του σκέλους (p=0.002). Από την παρατήρηση στο οπτικό μικροσκόπιο δεν προέκυψαν συμπεράσματα, ενώ βρέθηκαν ελαττωμένες βλάβες σε κυτταρικό επίπεδο στην ομάδα που έλαβε ΑΤ ΙΙΙ από την παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Στον καρδιακό ιστό βρέθηκε ότι η ομάδα που έλαβε ΑΤ ΙΙΙ είχε συνολικά στατιστικά σημαντικά χαμηλότερες τιμές MDA σε σχέση με την ομάδα που έλαβε φυσιολογικό ορό (p=0.005). Ανάμεσα στις υποομάδες δεν βρέθηκε να υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά ως προς το χρόνο της επαναιμάτωσης 0’ (p=0.07), 30’ (p=0.07), 4h (p=0.2). Από την παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διερχόμενης δέσμης στην ομάδα που δεν έλαβε ΑΤ ΙΙΙ είχαμε καταστροφή των σαρκομερίων, ενδοκυττάριο οίδημα και ελεύθερα μυϊκά ινίδια στις 4 ώρες επαναιμάτωσης ενώ άμεσα μετά την επαναιμάτωση δηλαδή σε χρόνο μηδέν είχαμε ενδοκυττάριο οίδημα που δεν παρατηρείται στη ομάδα που έλαβε ΑΤ ΙΙΙ. Από την παρατήρηση στο οπτικό μικροσκόπιο δεν προέκυψαν αξιόλογα ευρήματα. Συμπεράσματα: H θεραπεία με AT III εξασκεί αντιφλεγμονώδη και αντιοξειδωτική δράση στους πνεύμονες και το μυοκάρδιο κατά την χορήγηση της 30 λεπτά πριν από την άρση της ισχαιμίας των κάτω άκρων μετά από οξεία απόφραξη μειώνοντας το οξειδωτικό stress και αυξάνοντας την βιωσιμότητα των παραπάνω ιστών.