Ιοειδή μηλοειδών και πυρηνοκάρπων στην Ελλάδα: μοριακός χαρακτηρισμός και φυλογενετικές σχέσεις

Abstract

The objective of this study is the research of viroids that infect wild and cultivated pome and stone fruit trees in Greece (presence, identification, geographic distribution, molecular characterization and phylogenetic relationships). Previous reports were confirmed, regarding the presence in Greece of Apple scar skin viroid (ASSVd) and Pear blister canker viroid (PBCVd) in pome fruit, and Hop stunt viroid (HSVd) in apricot, by means of molecular hybridization, RT-PCR, cloning and sequencing. This work is the first report of ASSVd in sweet cherry, HSVd in apple, wild apple and bullace plum and PBCVd in apple and wild apple. The frequency of ASSVd, PBCVd and HSVd, according to the molecular hybridization data obtained from 1178 pome and stone fruit samples, is high (over 30%) in pome (pear, quince, apple, wild apple [Malus sylvestris] and wild pear [Pyrus amygdaliformis]) and stone (almond, wild almond [Prunus communis], apricot, plum, cherry, bullace plum, peach) fruit trees in Peloponnessos (Argolis, Arcadia, Achaia and Corinthia) and Central-Western Macedonia (Pella, Fiorina) and lower in Attica, Emathia and Magnesia. In addition, mixed infections of 2 or 3 of the viroids forementioned were found in 63 trees. In this study, 86 Hellenic viroid sequences were obtained in total: 44 ASSVd from apple, wild apple, pear, wild pear and sweet cherry, 21 PBCVd from apple, wild apple, pear, wild pear and quince, 21 HSVd from apple, wild apple, sweet cherry, peach, apricot, Japanese plum and bullace plum. All 3 viroids (ASSVd, PBCVd, HSVd) were completely sequenced in 2 trees (apple and wild apple), and (ASSVd+PBCVd) in 6 more trees (2 apple, 3 pear and 1 wild apple tree). Molecular characterization and phylogenetic analysis were conducted for 70 complete sequences (42 ASSVd, 16 PBCVd και 12 HSVd). The 42 complete Hellenic ASSVd sequences share great identity (99-100%) with Asian sequences from apple and significant variation among themselves (16%), equal to the variation within Chinese ASSVd sequences. Three Hellenic variants from apple (Pella), wild apple (Pella) and pear (Achaia) have been found identical with each other and identical with another group of 3 apple variants from China. The Hellenic sequences are clustered in 2 or 3 ASSVd phylogenetic clusters. Most Hellenic sequences have linear secondary structures. Fourteen of the 16 complete Hellenic PBCVd sequences have little homology with Australian sequences from pear, Japanese pear and quince and other 2 great homology (97-98%) with international sequences from pear. At the same time, the Hellenic sequences show significant variation among themselves (16%), which is double the variation of the rest, non-Hellenic sequences. The local wide host range of PBCVd includes 5 pome fruit species (2 wild species). The Hellenic sequences are clustered in 2 groups. Most Hellenic PBCVd sequences have branched secondary structures. The 12 complete Hellenic HSVd sequences show significant heterogeneity (17%) among themselves, whereas 10 of them include a replication of 4-10 nts, not found in sequences from abroad. These data suggest the presence of the viroid in Greece for a long time. Eight ofthe complete Hellenic sequences belong to the HSVdP group (dapple plum and peach fruit) and have branched secondary structures. The rest of the 4 Hellenic sequences are grouped in the HSVd-H cluster (hop stunt). The secondary structure of the 4 sequences is linear with elements of the HSVd-P group. Three other, formerly characterized Hellenic sequences from apricot, are clustered in the group HSVd P-H/C3, which derives from recombination events between the previous 2 groups, while sequences belonging to the groups HSVd-P and HSVd-H were found to coexist in a wild apple tree, as well as in 2 neighboring apple trees in an orchard in Sarakini, Pella. These facts are indications of a possible recombination event in Greece. The symptomatology observed in some of the trees harboring the Hellenic variants includes symptoms on apple, bullace plum and peach fruit, resembling those ofthe dapple plum and peach fruit disease in Italy and Japan. From this study, it seems that ASSVd, PBCVd and HSVd are widely spread in Greek pome and stone fruit trees, as well as their wild relative species. This fact, combined with the great variation found in the Hellenic viroid sequences, as well as the presence of mixed infections, gives a strong indication that these viroids coexist with the local wild and cultivated species for a very long time and are possibly native in our country.

Αντικείμενο της παρούσης έρευνας αποτελεί η αναλυτική έρευνα των ιοειδών που προσβάλλουν τα μηλοειδή και τα πυρηνόκαρπα στην Ελλάδα (παρουσία, ταυτοποίηση, γεωγραφική εξάπλωση, μοριακός χαρακτηρισμός και φυλογενετικές σχέσεις). Επιβεβαιώθηκαν προηγούμενες αναφορές για την παρουσία στην Ελλάδα των ιοειδών της εσχαρώσεως του φλοιού του μήλου (Apple scar skin viroid, ASSVd) και του εξανθηματικού έλκους της απιδιάς (Pear blister canker viroid, PBCVd) σε μηλοειδή και του νανισμού του λυκίσκου (Hop stunt viroid, HSVd) σε βερυκοκκιά με μοριακό υβριδισμό, RT-PCR, κλωνοποίηση και αλληλούχηση. Η παρούσα εργασία περιλαμβάνει την πρώτη διεθνή καταγραφή του ASSVd σε κερασιά, του HSVd σε μηλιά, άγρια μηλιά και κορομηλιά και του PBCVd σε μηλιά και άγρια μηλιά. Η συχνότητα εμφανίσεως των ASSVd, PBCVd και HSVd, σύμφωνα με τα δεδομένα του μοριακού υβριδισμού σε 1178 δείγματα μηλοειδών και πυρηνοκάρπων, είναι υψηλή (άνω του 30%) σε μηλοειδή (απιδιές, κυδωνιές, μηλιές, αγριομηλιές [Malus sylvestris] και αγριαπιδιές [Pyrus amygdaliformis]) και πυρηνόκαρπα (αμυγδαλιές, αυτοφυείς αμυγδαλιές [Prunus communis], βερυκοκκιές, δαμασκηνιές, κερασιές, κορομηλιές, ροδακινιές) στην Πελοπόννησο (Αργολίδα, Αρκαδία, Αχαΐα και Κορινθία) και την Κεντροδυτική Μακεδονία (Πέλλα, Φλώρινα) και πιο χαμηλή σε Αττική, Ημαθία και Μαγνησία. Επίσης, διαπιστώθηκαν μικτές μολύνσεις 2 ή 3 ιοειδών από τα παραπάνω στις περιπτώσεις 63 δένδρων. Αποκτήθηκαν συνολικά 86 ελληνικές αλληλουχίες ιοειδών: 44 ASSVd, από μηλιά, άγρια μηλιά, απιδιά, αγριαπιδιά και κερασιά, 21 PBCVd, από μηλιά, άγρια μηλιά, απιδιά, αγριαπιδιά και κυδωνιά, και 21 HSVd από μηλιά, άγρια μηλιά, κερασιά, ροδακινιά, βερυκοκκιά, ιαπωνική δαμασκηνιά και κορομηλιά. Σε 2 δένδρα (μηλιά και άγρια μηλιά), αλληλουχήθηκαν πλήρως και τα 3 ιοειδή (ASSVd, PBCVd, HSVd), ενώ σε άλλα 6 (2 μηλιές, 3 απιδιές και 1 άγρια μηλιά) τα ASSVd και PBCVd. Σε 70 πλήρεις αλληλουχίες (42 ASSVd, 16 PBCVd και 12 HSVd) έγινε μοριακός χαρακτηρισμός και φυλογενετική ανάλυση. Οι 42 πλήρεις ελληνικές αλληλουχίες του ASSVd έχουν μεγάλη ομοιότητα (99-100%) με ασιατικές αλληλουχίες από μηλιά και σημαντική παραλλακτικότητα (έως 16%) μεταξύ τους, εφάμιλλη αυτής εντός των κινεζικών. Τρεις ελληνικές παραλλαγές από μηλιά (Πέλλα), άγρια μηλιά (Πέλλα) και απιδιά (Αχαΐα) βρέθηκαν πανομοιότυπες, τόσο μεταξύ τους, όσο και με 3 κινεζικές παραλλαγές από μηλιά. Οι ελληνικές αλληλουχίες εντάσσονται σε 2 ή 3 φυλογενετικά αθροίσματα. Οι περισσότερες ελληνικές αλληλουχίες έχουν ευθύγραμμη δευτεροταγή δομή. Οι 14 από τις 16 πλήρεις ελληνικές αλληλουχίες του PBCVd έχουν μικρή ομοιότητα με αυστραλιανές αλληλουχίες από απιδιά, ασιατική απιδιά και κυδωνιά, και άλλες 2 μεγάλη ομοιότητα (97-98%) με διεθνείς αλληλουχίες από απιδιά. Ταυτόχρονα οι ελληνικές αλληλουχίες έχουν σημαντική παραλλακτικότητα (έως 16%) μεταξύ τους, διπλάσια όλων των υπολοίπων μη ελληνικών αλληλουχιών. Το εγχώριο εύρος ξενιστών του PBCVd περιλαμβάνει 5 είδη μηλοειδών (2 αυτοφυή). Οι ελληνικές αλληλουχίες εντάσσονται σε 2 φυλογενετικά αθροίσματα. Οι περισσότερες ελληνικές αλληλουχίες έχουν διακλαδισμένη δευτεροταγή δομή. Οι 12 πλήρεις ελληνικές αλληλουχίες του HSVd έχουν σημαντική ετερογένεια (έως 17%) μεταξύ τους, ενώ 10 από αυτές φέρουν μια αναδιπλασιασμένη περιοχή 4-10 νουκλεοτιδίων, η οποία δεν έχει βρεθεί σε αλληλουχίες του εξωτερικού. Οι 8 από τις πλήρεις ελληνικές αλληλουχίες ανήκουν στην ομάδα HSVd-P (dapple plum and peach fruit) και έχουν διακλαδισμένη δευτεροταγή δομή. Οι υπόλοιπες 4 ελληνικές αλληλουχίες εντάσσονται στην ομάδα HSVd-H (hop stunt). Η δευτεροταγής δομή των 4 αλληλουχιών είναι ευθύγραμμη, με στοιχεία που παραπέμπουν στην ομάδα HSVd-P. Άλλες 3 ελληνικές αλληλουχίες από βερυκοκκιά, οι οποίες χαρακτηρίστηκαν παλαιότερα, εντάσσονται στην ομάδα HSVdP-H/C3, η οποία προέρχεται από ανασυνδυασμό των προηγούμενων 2 ομάδων, ενώ αλληλουχίες των ομάδων HSVd-P και HSVd-H βρέθηκαν να συνυπάρχουν σε ένα δένδρο άγριας μηλιάς, καθώς και σε 2 γειτονικά δένδρα μηλιάς σε οπωρώνα των Σαρακηνών (Ν. Πέλλας). Αυτά αποτελούν ένδειξη πιθανού τέτοιου ανασυνδυασμού στην Ελλάδα. Η συμπτωματολογία ορισμένων φυτών που φιλοξενούν τις ελληνικές παραλλαγές περιλαμβάνει συμπτώματα σε καρπούς μηλιάς, κορομηλιάς και ροδακινιάς, τα οποία μοιάζουν με εκείνα της ασθένειας dapple plum and peach fruit στην Ιταλία και την Ιαπωνία. Από τη μελέτη αυτή, φαίνεται πως τα ASSVd, PBCVd και HSVd είναι αρκετά διαδεδομένα στην Ελλάδα, στα μηλοειδή και πυρηνόκαρπα και σε άγρια συγγενικά τους είδη. Αυτό το γεγονός, σε συνδυασμό με τη μεγάλη παραλλακτικότητα που βρέθηκε στις ελληνικές αλληλουχίες, αλλά και τις μικτές μολύνσεις, αποτελεί ισχυρή ένδειξη ότι τα ιοειδή αυτά συνυπάρχουν με τα εντόπια άγρια και καλλιεργούμενα είδη φυτών για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα και είναι πιθανώς ιθαγενή στη χώρα μας.