Μελέτη της επίδρασης φαρμακολογικών παραγόντων στην ανάπτυξη του κρανίου και των οδόντων θηλαστικών

Abstract

The organogenesis of head, jaws and teeth is coordinated by many intrinsic growth and morphogenetic factors. Retinoic acid (RA) and bone morphogenetic protein 4 (BMP4) possess a prominent place among them. RA (oxidized form of vitamin A) plays a primary role in the expression of Hox genes, which control and regulate organ morphogenesis at their appropriate position along the anterior/posterior axis of the developing embryo. BMP4 participates actively to cranial bone morphogenesis and in the differentiation of odontoblasts and smaltoblasts, whereas it induces the differentiation of tooth pulp mesenchymal cells into odontoblasts, a fact which might be used profitably in clinical applications for therapeutic purposes. In most embryonic animal models the action of several morphogenetic factors depends on various other factors as well as on their antagonists. For the purposes of the present assay it is worth noting that RA and BMP4 are mutually interactive: BMP4 attenuates signalling of the RA pathway, whereas, inhibition of RA synthesis diminishes BMP4 expression. Disturbances in their interaction might lead to morphogenetic abnormalities, which in their turn would indicate whether an exogenously administered substance is harmful for the embryos. This research program was motivated by the fact that, inhibitors of RA and antagonists of BMP4 might frequently contact human tissues (voluntary and involuntary, as well as consciously and inconciously) with unanticipated, adverse effects. A distal goal of similar studies is their contribution in the prevention of side –effects and in clinical applications. In order to achieve our purposes we have used common white mice (balb-c Mus musculus) being at their 9th day of gestation. The animals received a single intra-abdominal injection of 3 μL citral/gbw or 50 μg αnti-BMP4 antibody. We are aware that results from animal studies cannot be directly translated to humans, however, in the case of mouse there is a lot of evidence advocating their use as models for human affairs. The study was performed on newborns within 5 hours after birth. Our results were evaluated by the following methods: (a) Macroscopically, including body weight, length of body, tail and limbs. Presence, number and position of various organs (eyes, ears, nose, whiskers, digits) was inspected. (b) Stereoscopically, after Alcian blue and alizarin red S double staining for mucopolysaccharides and bone, respectively. (c) Microscopically, after (c1) histological staining of paraffin section (c2) immunohistochemical detection of apoptosis (c3) immunohistochemical detection of BMP4 distribution (c4) scanning electron microscopy During the course of the present study, a retinoic acid inhibitor (citral) and a BMP4 neutralizer (anti-BMP4 antibody) were intra-abdominally injected into pregnant mice. Macroscopical examination did not reveal any difference or external variations/abnormalities between control and experimental newborns. This result might mean that the quantities and the mode of application of those substances do not cause external variations. This result might well be due to the action of other, similar factors. The simplest explanation is that the free quantities of RA and BMP4 are sufficient to produce the normal external phenotype. However, double staining of cartilage and bone revealed retardation in osteogenesis in experimental animals. Our results are in full agreement with similar studies concerning action of BMP4 and their antagonists in developmental processes, such as neurulation, chondrogenesis and head morphogenesis. The introduction into the developing embryo of a quantity of BMP4 antagonist diminishes part of the free BMP4 resulting in the expression of survival factors (e.g., FGF8) a fact which elongates the life span of mesenchymal cells and retards their differentiation into osteoblasts. In addition, the presence of citral inhibits the action of retiladehyde dehydrogenase, diminishes RA quantity resulting in diminution of expression of the osteocalcin gene, a fact which disturbs osteogenesis. In agreement with the above, comparison of histological slides between experimental and control animals showed that, RA insufficiency (caused by citral) and presence of anti-BMP4 antibody (restriction of free BMP4 molecules) causes some minor deviations from the normal phenotype and/or in the time of display of the normal phenotype. Reports from other laboratories support the notion that RA insufficiency diminishes Shh gene expression, a fact which affects Bmps gene expression, so that the differentiation of mesenchymal cells into osteoblasts/odontoblasts is inhibited or retarded. The physiological phenotype of the experimental animals grown to adulthood indicates that the two substances tested at these comparatively high quantities are quite safe, at least for the species studied (Mus musculus). However, it must be emphatically stressed that the quantity of a substance, that externally administered causes from mild and reparable microvariations from the normal phenotype to serious morphogenetic abnormalities and teratogenesis differs significantly from species to species. Briefly, the results of my PhD Thesis indicate that, in vivo administration of citral (i.e., a process which restricts the synthesis of the needed quantity of RA) disturbs (usually restriction/retardation) chondrogenesis and osteogenesis in head skeletal elements. After birth, apoptosis is not detected at both experimental and control animals. In vivo administration of anti-BMP4 antibody results in a transient disturbance in the «physiological» course of odontoblast differentiation and in the production of pre-dentin, whereas, the retardation in osteogenesis includes alveolar bones too.

Η φυσιολογική οργανογένεση της κεφαλής, των γνάθων και των οδόντων κατά την πορεία της εμβρυϊκής ανάπτυξης ελέγχεται, ρυθμίζεται και συντονίζεται από πολλούς ενδογενείς αυξητικούς και μορφογενετικούς παράγοντες. Δύο από τους σημαντικότερους είναι το ρετινοϊκό οξύ (RA) και ο οστεομορφογενετικός παράγων 4 (BMP4, bone morphogenetic protein). To RA (οξειδωμένο παράγωγο της βιταμίνης Α) διαδραματίζει πρωτεύοντα ρόλο στην έκφραση των Hox γονιδίων, τα οποία ελέγχουν τη μορφογένεση των οργάνων στη σωστή θέση τους κατά μήκους του προσθιοπίθιου άξονα του σώματος του αναπτυσσόμενου εμβρύου. Η BMP4 συμμετέχει ενεργά στη διαφοροποίηση των κρανιακών οστών, των οδοντινοβλαστών και των αδαμαντινοβλαστών, ενώ επάγει τη δημιουργία οδοντινοβλαστών από μεσεγχυματικά κύτταρα του οδοντικού πολφού, γεγονός που μπορεί να τύχει κλινικής εφαρμογής σε θεραπευτική αγωγή. Στα περισσότερα ζωικά, εμβρυϊκά μοντέλα η δράση των διαφόρων μορφογενετικών παραγόντων ρυθμίζεται και εξαρτάται και από ποικίλους άλλους παράγοντες καθώς και από συγκεκριμένους τύπους ανταγωνιστών τους. Για την παρούσα μελέτη αξίζει να σημειωθεί ότι τα δύο ανωτέρω μόρια αλληλοεπηρεάζονται: η BMP4 εξασθενεί τη σηματοδότηση του μονοπατιού του RA, ενώ η αναστολή της σύνθεσης του RA ελαττώνει την έκφραση της BMP4. Διαταραχές στην παρουσία/συγκέντρωση/δραστικότητά τους μπορεί να οδηγήσουν σε μορφογενετικές ανωμαλίες, οπότε, κατά συνέπεια, συστηματική εμφάνιση τέτοιων συγγενών ανωμαλιών θα μπορούσε να δείξει αν μια εξωγενώς χορηγούμενη ουσία είναι επικίνδυνη/βλαπτική για το έμβρυο. Κίνητρο για αυτή τη μελέτη ήταν το γεγονός ότι, αναστολείς του RA και ανταγωνιστές της BMP4 μπορεί να έλθουν σε επαφή με ιστούς του ανθρώπου (τόσο εκούσια όσο και ακούσια, ή/και ασυνείδητα) με απρόβλεπτες, δυσμενείς συνέπειες. Συγκεκριμένα, έχει αρχίσει πειραματική χορήγηση της BMP4 για διάφορους θεραπευτικούς σκοπούς με πιθανό ενδεχόμενο την επαγωγή αντι-ΒΜΡ4 αντισωμάτων, ενώ ένας αναστολέας της σύνθεσης του ρετινοϊκού οξέος (το citral) χρησιμοποιείται σε όλα τα «νοικοκυριά». Απώτερος στόχος αυτής της μελέτης είναι η συμβολή των αποτελεσμάτων της στην πρόληψη των παρενεργειών και σε κλινικές εφαρμογές. Για την επίτευξη αυτού του στόχου 60 λευκά θηλυκά ποντίκια (balb-c Mus musculus) βάρους περίπου 35±2 γραμμαρίων συνευρέθησαν με αρσενικά κατά τη διάρκεια μιας νύκτας. Αύξηση του σωματικού βάρους κατά τέσσερα περίπου γραμμάρια κατά την 8η ημέρα μετά τη συνεύρεση συνήθως σημαίνει επιτυχή εγκυμοσύνη, οπότε την 9η ημέρα κύησης ενέθηκαν ενδοκοιλιακά με 3 μL citral/gbw ή 50 μg αντι-BMP4 αντισώματος. Βεβαίως, τα αποτελέσματα από τις μελέτες σε ζώα δεν έχουν πάντα άμεση εφαρμογή και στον άνθρωπο, ωστόσο εν γένει αποτελούν μια αξιόπιστη απαρχή αφού υπάρχει πληθώρα ανατομικών και φυσιολογικών ομοιοτήτων μεταξύ ποντικού και ανθρώπου, συμπεριλαμβανομένης της περιόδου της εμβρυϊκής ανάπτυξης. Τα 200 περίπου νεογέννητα που συμπεριελήφθησαν στα αποτελέσματα αυτής της διατριβής υπέστησαν επεξεργασία το αργότερο 5 ώρες μετά τη γέννησή τους. Τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν με διάφορες μεθόδους: (α) Μακροσκοπικά, περιλαμβάνοντας μετρήσεις βάρους σώματος και μήκους κεφαλής, σώματος, ουράς και άκρων. Ελέγχθηκε η παρουσία και σωστή θέση των κυριότερων στοιχείων (μάτια, αυτιά, μύτη, δάχτυλα, κλπ.). (β) Στερεοσκοπικά, ύστερα από διπλή χρώση βλεννοπολυσακχαριτών και οστίτη ιστού και διαφανοποίηση ολοκλήρου του ζώου. (γ) Μικροσκοπικά, ύστερα από (γ1) ιστολογική χρώση σε τομές παραφίνης (γ2) ανοσοϊστοχημική αποκάλυψη απόπτωσης (γ3) ανοσοϊστοχημική ανίχνευση της κατανομής της BMP4 και, (γ4) ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης Στην παρούσα εργασία, ένας αναστολέας της σύνθεσης του ρετινοϊκού οξέος (citral) και ένας ανταγωνιστής της BMP4 (αντι-ΒΜΡ4 αντίσωμα) χορηγήθηκαν με μια απλή ενδοκοιλιακή ένεση σε έγκυα ποντίκια η δε μακροσκοπική, εξωτερική εξέταση των νεογέννητων δεν αποκάλυψε καμιά φαινοτυπική εξωτερική ανωμαλία. Μετρήθηκαν το βάρος και το μήκος του σώματος, των άκρων, και παρατηρήθηκε η φυσιολογική, εξωτερική μορφολογία όλων των εξωτερικών γνωρισμάτων. Η ποιοτική παρατήρηση καθώς και η στατιστική επεξεργασία (t-test) ποσοτικών μεγεθών δεν αποκάλυψε καμιά διαφορά μεταξύ μαρτύρων και πειραματικών ζώων. Αυτό ίσως σημαίνει ότι οι ποσότητες και ο τρόπος χορήγησης αυτών των ουσιών δεν προκαλεί καμία «εξωτερική» ανωμαλία στα νεογέννητα. Η πιο απλή εξήγηση είναι ότι οι ελεύθερες ποσότητες των δραστικών παραγόντων είναι επαρκείς για την τελική δημιουργία του φυσιολογικού εξωτερικού φαινοτύπου. Ωστόσο, διπλή χρώση οστίτη ιστού και χόνδρου σε νεογέννητα αποκάλυψε καθυστέρηση στην οστεογένεση στα πειραματικά ζώα, κυρίως σε κρανιακά οστά. Αυτές οι διαφορές φαίνεται να συσχετίζονται με την εμβρυολογική προέλευση των οστών (μεσέγχυμα, νευρική ακρολοφία) καθώς και τον τρόπο οστεοποίησης (υμενογενής, χονδρογενής). Αυτό το αποτέλεσμα ευρίσκεται σε πλήρη συμφωνία με άλλες μελέτες για την εμπλοκή της BMP4 και των ανταγωνιστών της σε διαδικασίες εμβρυϊκής ανάπτυξης, νευριδίωσης, χονδρογένεσης και μορφογένεσης κεφαλής. Η εισαγωγή στο έμβρυο ποσότητας ανταγωνιστού της BMP4 ελαττώνει τη φυσιολογική ποσότητά της BMP4 με αποτέλεσμα την έκφραση παραγόντων επιβίωσης (π.χ., FGF8) γεγονός που επιμηκύνει τη ζωή των μεσεγχυματικών κυττάρων και καθυστερεί τη μετάπτωσή τους σε οστεοβλάστες. Επιπρόσθετα, η παρουσία citral παρεμποδίζει τη δράση της αφυδρογονάσης της ρετιναλδεΰδης, ελαττώνεται η ποσότητα του RA, οπότε ελαττώνεται και η ενεργοποίηση του γονιδίου της οστεκαλτσίνης με αποτέλεσμα τη διαταραχή της οστεοποίησης. Πέραν αυτού, σε μετακρανιακό επίπεδο παρατηρήθηκε μια αρκετά γνωστή «ανωμαλία» που χαρακτηρίζεται από ασύμμετρο (ζικ-ζακ) ζευγάρωμα των συζυγών θωρακικών πλευρών (7) με το στέρνο. Σε συμφωνία με τα παραπάνω, σύγκριση ιστολογικών τομών παραφίνης μαρτύρων με πειραματικά ζώα έδειξε ότι, ανεπάρκεια RA (προκαλούμενη από το citral) και παρουσία anti BMP4-αντισώματος (περιορισμός ελεύθερων BMP4 μορίων) έχει συνέπειες στο φαινότυπο των στοιχείων που περιγράφονται στα «Αποτελέσματα», ή/και στον χρόνο εκδήλωσης του φυσιολογικού φαινότυπου. Λεπτομερέστερα, καταγράφτηκε μεταβολή στις συγκλεισιακές σχέσεις μεταξύ των οδόντων της άνω και της κάτω γνάθου, εντοπίστηκε σε ορισμένες περιπτώσεις υπερωϊοσχιστία, εκδηλώθηκε μεταβολή στο πρότυπο οστεοποίησης τόσο των κρανιακών όσο και των φατνιακών οστών, διαπιστώθηκε διαφορά στην κατανομή του ΒΜΡ4, αλλαγή στη διάταξη των οδοντινοβλαστών, στο μέγεθος της οδοντινικής αποφυάδας και στην απόθεση της προοδοντίνης, και παρατηρήθηκε αλλαγή στην αδαμαντινογένεση κατά το διάστημα της εμβρυϊκής ζωής. Στη διεθνή βιβλιογραφία υποστηρίζεται ότι ανεπάρκεια RA μειώνει την έκφραση του γονιδίου Shh, γεγονός που επηρεάζει την έκφραση των Bmps, οπότε παρεμποδίζεται/καθυστερεί η μετατροπή των μεσεγχυματικών κυττάρων σε οστεοβλάστες/οδοντοβλάστες. Από τον φυσιολογικό φαινότυπο των πειραματικών ζώων τα οποία μελετήθηκαν αφού «ενηλικιώθηκαν» συμπεραίνεται ότι οι δύο ανωτέρω ουσίες, (τουλάχιστον για το είδος (Mus musculus) που μελετήθηκαν και για τις συγκριτικά πολύ μεγάλες ποσότητες που χορηγήθηκαν), είναι απόλυτα ασφαλείς και ακίνδυνες. Ωστόσο, θα πρέπει να τονισθεί με έμφαση ότι η ποσότητα μιας ουσίας που, χορηγούμενη εξωγενώς προκαλεί από ελαφρές και αναστρέψιμες μικροδιαφορές από τον φυσιολογικό φαινότυπο έως μορφογενετικές ανωμαλίες και τερατογένεση διαφέρει σημαντικά από είδος σε είδος. Σε γενικές γραμμές τα αποτελέσματα της διατριβής μου δείχνουν ότι, η in vivo χορήγηση citral (δηλαδή, μια διαδικασία που περιορίζει τη σύνθεση της φυσιολογικής ποσότητας ρετινοϊκού οξέος) προκαλεί διαταραχή (συνήθως περιορισμό/καθυστέρηση) στη χονδρογένεση και οστεογένεση των κρανιακών οστών. Μετά τη γέννηση του ζώου δεν παρατηρείται απόπτωση ούτε στα ζώα «citral» ούτε στους μάρτυρες. In vivo χορήγηση anti-BMP4 αντισώματος έχει ως συνέπεια μια παροδική διαταραχή στη «φυσιολογική» πορεία διαφοροποίησης των οδοντινοβλαστών, στην παραγωγή της προ-οδοντίνης και στη υφή της αδαμαντίνης, ενώ η καθυστέρηση στην οστεοποίηση περιλαμβάνει και τα φατνία. «Αδέλφια» αυτών των ζώων που μεγάλωσαν με τη μητέρα τους, εξετάσθηκαν μετά την έκφυση όλων των δοντιών τους, και καταγράφτηκε σε όλα φυσιολογικός φαινότυπος.