Επαναπροσδιορισμός της γονεϊκής αποτύπωσης στα πρώτα στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης

Abstract

The epigenetic regulatory mechanism of DNA methylation plays crucial role in cell differentiation, regulation of gene expression, genome reprogramming and silencing of repetitive elements. In mammals, epigenetic reprogramming occurs during early development. After fertilization, massive DNA demethylation of paternal and maternal genome takes place in order to reset parent-of-origin based genomic imprinting, followed by de novo methylation at the blastocyst stage, establishing a new methylation pattern. This methylation reprogramming during preimplantation stages of embryo development creates a window of opportunity for the expression of transcriptional factors Oct-4, Sox 2 and Nanog, crucial for the establishment and maintenance of pluripotency and self-renewal of Embryonic Stem Cells in preimplantation embryo. In addition, until now suppressed retroelements can be reactivated and amplify themselves in the genome. LINE-1 are active retroelements which have been implicated in many human diseases, chromosome rearrangements and gene silencing and found to be expressed in undifferentiated human ESCs. Aim of this study was the determination of stage-specific expression of the three major transcriptional factors (Oct-4, Sox2, Nanog), the study of DNA methylation reprogramming during preimplantation stages of embryo development and to investigate the correlation of L1 retrotransposition with the epigenetic mechanism of methylation and genome instability.At first, we used specific antibodies against Oct4, Nanog and Sox2 in order to determine their expression during human preimplantation development. Indirect immunofluorescense analysis of preimplantation embryos revealed that the Oct4 is the factor expressed first at 8-cell embryos. The expression was the same at all blastomeres up to morula stage. In blastocyst, fluorescence signals were restricted to ICM. Sox2 expression was detected at early morula followed by Nanog expression at late morula stage. In blastocyst, Nanog and Sox2 expression was restricted to ICM following Oct-4 expression pattern. Oct-4, Sox2 and Nanog comprise the core of the regulatory network for the maintenance of pluripotency and self-renewal. The expression patterns of the three factors indicate that Oct-4 is the major transcriptional factor which regulates the expression of Sox2 and synergistically regulate the expression of Nanog.The second stage of our study was to examine the methylation pattern during human preimplantation development. Indirect imunnofluorescense using specific antibody against 5-methylcytidine revealed that strong methylation from zygote to 4-cell embryo. Methylation was weak at 8-cell embryo and reached at its nadir at morula stage. Strong fluorescence signals were detected at blastocyst, indicating de novo methylation. In order to investigate the impact of retrotransposition on methylation reprogramming and genome stability, we induced L1 retrotransposition through microinjection of recombinant L1 plasmids in spare human oocytes matured in vitro via ICSI. Then, indirect immunofluorescense of zygotes and preimplantation embryos using antibodies against 5-methylcytidine and γH2AX allowed us to observe changes to methylation patterns and DNA DSBs. As it concerns the methylation status, zygotes and preimplantation embryos positive to L1 retrotransposition have shown no differences to methylation patterns in comparison with control samples. It has to be mentioned that the embryos were up to 6-cell. A hypothesis that could explain the lack of differences in methylation status is that the embryos up to morula stage are under massive demethylation process so it couldn’t be able to detect the impact of induced retrotransposition to de novo methylation process. Retroelements are considered to be marks for methylation, so rising of L1 sequence copies into the embryo genome should result to higher methylation levels. In the final step, immunofluorescense signals for γH2AX were detected at zygote and preimplantation embryos after induction of L1 retrotransposition. The formation of γH2AX foci demonstrate that expression of the human L1 retroelement creates DSBs and subsequent genomic instability probably due to inefficient repair in all cells of the embryo.Our results demonstrate the expression patterns of pluripotency factors Oct-4, Sox2, Nanog during human preimplantation development. Exhibit the epigenetic reprogramming through methylation changes that occur from zygote to blastocyst. Finally, our data provide evidence for the first time that L1 retrotransposition in human preimplantation embryos induce double strand breaks.

Ο επιγενετικός μηχανισμός της μεθυλίωσης του DNA διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση του κυττάρου, στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, στον επαναπρογραμματισμό του γενώματος και στην καταστολή των μεταθετών στοιχείων. Στα θηλαστικά, ο επιγενετικός επαναπρογραμματισμός επιτελείται στα πρώιμα στάδια ανάπτυξης του εμβρύου. Μετά τη γονιμοποίηση, λαμβάνει χώρα καθολική απομεθυλίωση του πατρικού και μητρικού γενώματος με σκοπό τη διαγραφή της γενωμικής αποτύπωσης που φέρουν οι γονείς. Την απομεθυλίωση ακολουθεί η εκ νέου μεθυλίωση στο στάδιο της βλαστοκύστης η οποία εγκαθιδρύει ένα νέο πρότυπο μεθυλίωσης. Ο επαναπροσδιορισμός του προτύπου μεθυλίωσης στα προεμφυτευτικά στάδια ανάπτυξης του εμβρύου αποτελεί ένα “παράθυρο ευκαιρίας” για την έκφραση των κύριων παραγόντων πολυδυναμίας Oct-4, Sox 2 και Nanog, απαραίτητοι για την εγκαθίδρυση και διατήρηση της πολυδυναμίας και της ικανότητας αυτό-αναγέννησης των εμβρυϊκών στελεχιαίων κυττάρων στο προεμφυτευτικό έμβρυο. Επιπροσθέτως, τα έως τώρα ανενεργά ρετρομεταθετά στοιχεία έχουν τη δυνατότητα να επανενεργοποιηθούν και να ρετρομετατεθούν στο γένωμα. Τα LINE-1 είναι ενεργά ρετρομεταθετά στοιχεία τα οποία σχετίζονται με αρκετά νοσήματα στον άνθρωπο, εμπλέκονται σε χρωμοσωματικές ανακατατάξεις και στην αποσιώπηση γονιδίων και έχει διαπιστωθεί ότι είναι ενεργά στα αδιαφοροποίητα ESCs του ανθρώπου. Σκοπός της παρούσης μελέτης ήταν να μελετήσουμε έκφρασης των παραγόντων Oct-4, Sox2 και Nanog καθώς και να προσδιορίσουμε το πρότυπο μεθυλίωσης στα προεμφυτευτικά στάδια ανάπτυξης του εμβρύου στον άνθρωπο καθώς και να ερευνήσουμε την επίδραση της επαγόμενης ρετρομετάθεσης του L1 στον επιγενετικό μηχανισμό της μεθυλίωσης και στη σταθερότητα του γενώματος.Αρχικά, με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού και με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων για τους παράγοντες Oct-4, Sox2 και Nanog μελετήσαμε την έκφρασή τους στα προεμφυτευτικά έμβρυα. Η έκφραση του παράγοντα Oct-4 ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά σε έμβρυα στο στάδιο των 8 κυττάρων και ήταν ίδια σε όλα τα βλαστομερίδια μέχρι το στάδιο του μοριδίου. Στη βλαστοκύστη, σήματα φθορισμού ανιχνεύθηκαν μόνο στα κύτταρα της ICM. Η έκφραση του Sox2 ανιχνεύθηκε στο στάδιο του πρώιμου μοριδίου και ακολούθησε η έκφραση του Nanog στο στάδιο του όψιμου μοριδίου. Στη βλαστοκύστη, η έκφραση των Sox2 και Nanog περιορίστηκε στην ICM ακολουθώντας το πρότυπο έκφρασης του Oct-4. Οι παράγοντες Oct-4, Sox2 και Nanog αποτελούν τον πυρήνα του ρυθμιστικού δικτύου που είναι υπεύθυνο για τη διατήρηση της πολυδυναμίας των κυττάρων και της ικανότητάς τους για αυτο-αναγέννηση. Τα πρότυπα έκφρασης των παραγόντων υποδεικνύουν ότι ο Oct-4 αποτελεί τον κύριο μεταγραφικό παράγοντα μεταξύ των τριών, ο οποίος ρυθμίζει την έκφραση του Sox2 και στη συνέχεια οι δύο παράγοντες συνεργατικά ελέγχουν την έκφραση του Nanog.Η δεύτερη φάση της μελέτης αφορούσε τη μελέτη του προτύπου μεθυλίωσης στα προεμφυτευτικά στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης. Με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού και χρησιμοποιώντας ειδικό αντίσωμα έναντι της 5-μεθυλοκυτιδίνης καταφέραμε να ανιχνεύσουμε τις μεθυλιωμένες κυτοσίνες στο γένωμα. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ισχυρή μεθυλίωση στο ζυγωτό και μέχρι το στάδιο των 4 κυττάρων. Σταδιακή απομεθυλιώση διαπιστώθηκε από το στάδιο των 8 κυττάρων και μέχρι το μοριδίο όπου η μεθυλίωση έφτασε στο κατώτατο επίπεδο. Στο στάδιο της βλαστοκύστης ανιχνεύθηκαν και πάλι σήματα φθορισμού υποδηλώνοντας την εκ νέου μεθυλίωση του γενώματος.Στα πλαίσια μελέτης της επίδρασης της ρετρομετάθεσης στον επαναπροσδιορισμό της μεθυλίωσης και τη σταθερότητα του γενώματος, επαγάγαμε τη ρετρομετάθεση του L1 ρετρομεταθετού στοιχείου μέσω της έγχυσης μικροποσότητας ανασυνδυασμένου L1 σε ανθρώπινα ωάρια κατά τη διαδικασία της μικρογονιμοποίησης. Με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού και τη χρήση ειδικών αντισωμάτων έναντι της 5-μεθυλοκυτιδίνης και της γΗ2ΑΧ είχαμε τη δυνατότητα να ανιχνεύσουμε αλλαγές στο πρότυπο μεθυλίωσης και θραύσεις του δίκλωνου μορίου DNA. Όσο αφορά τη μεθυλίωση, δεν εντοπίσαμε διαφορές στα ζυγωτά και προεμφυτευτικά έμβρυα στα οποία εισήχθη το L1 σε σύγκριση με τα δείγματα που χρησιμοποιήσαμε ως μάρτυρες (controls). Σε αυτό το σημείο θα πρέπει να αναφερθεί ότι τα δείγματα αφορούσαν έμβρυα μέχρι το στάδιο των 6 κυττάρων. Μία υπόθεση η οποία θα μπορούσε να ερμηνεύσει την έλλειψη διαφοράς στα επίπεδα μεθυλίωσης είναι ότι τα έμβρυα μέχρι το στάδιο του μοριδίου ακολουθούν μία διαδικασία καθολικής απομεθυλίωσης καθιστώντας αδύνατο να ανιχνεύσουμε την επίδραση της ρετρομετάθεσης στην εκ νέου μεθυλίωση. Τα ρετρομεταθετά στοιχεία αποτελούν στόχους μεθυλίωσης και ως εκ τούτου αναμένεται ότι η αύξηση των αντιγράφων L1 στο γένωμα θα έχουν ως αποτέλεσμα υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης του γενώματος.Τέλος, σε ζυγωτά και προεμφυτευτικά έμβρυα στα οποία επαγάγαμε τη ρετρομετάθεση του L1 ανιχνεύσαμε σήματα ανοσοφθορισμού για τη γΗ2ΑΧ. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι η έκφραση του L1 ρετρομεταθετού στοιχείου προκαλεί θραύσεις στο δίκλωνο μόριο του DNA , προκαλώντας ενδεχομένως γενωμική αστάθεια λόγω αδυναμίας επιδιόρθωσης στα κύτταρα του εμβρύου.Στην παρούσα μελέτη προσδιορίσαμε τα πρότυπα έκφρασης των κύριων παραγόντων πολυδυναμίας (Oct4, Sox2, Nanog) και αποτυπώσαμε τις μεταβολές στο πρότυπο μεθυλίωσης στα προεμφυτευτικά στάδια εμβρυϊκής ανάπτυξης στον άνθρωπο στα πλαίσια του επιγενετικού επαναρπογραμματισμού. Επιπλέον, αποδείξαμε για πρώτη φορά ότι πολλαπλά γεγονότα ρετρομετάθεσης στο προεμφυτευτικό έμβρυο στον άνθρωπο, προκαλούν θραύσεις στο δίκλωνο μόριο του DNA.