Μελέτη της έκφρασης και των μηχανισμών ρύθμισης των γονιδίων p63 και p73 στον καρκίνο του ενδομητρίου

Abstract

p63 plays an important role in several intracellular processes such as transcription activation and apoptosis. p63 has two N-terminal isoforms, TAp63 and DNp63. TAp63 isoform has p53-like functions, while DNp63 acts as a dominant negative inhibitor of the p53 family and is considered oncogenic. Although p63 and its isoforms are overexpressed in a wide variety of human malignancies such as cervical, head and neck, and lung cancer, their role in endometrial carcinoma has not been investigated. We measured by quantitative real-time polymerase chain reaction the mRNA expression of TAp63 and DNp63 in a series of 20 endometrioid adenocarcinomas paired with adjacent normal tissue. TAp63 isoform exhibited 1.8-fold overexpression in malignant samples, while DNp63 was 4.3-fold overexpressed in cancer specimens. Further analysis revealed that the DN/TA isoform ratio shifted from 0.5 in normal samples to 1.2 in tumor specimens. Statistical analysis also revealed an association of TAp63 expression with high body mass index (p = 0.034), late menopause (p = 0.020), and lower tumor grade (p = 0.034). DNp63 was also correlated with grade I/II tumors (p = 0.044). These results indicate that both p63 isoforms and especially DNp63 play an important role in the development and progression of grade I/II endoπmetrial adenocarcinoma, especially in obese and late-menopause women. p73 plays an important role in several intracellular processes such as transcription activation and apoptosis. Its promoters, P1 and P2, produce two different classes of proteins: those containing the transactivation domain (TAp73) and those lacking it (ΔNp73). TA-isoforms exhibit p53-like functions, while ΔΝ- isoforms act as dominant negative inhibitors of both wild-type p53 and TAp73. p73 is overexpressed in a wide variety of human tumors such as breast, lung, colon, bladder and ovarian cancer. We investigated the role of p73 isoforms in endometrial adenocarcinoma in a series of 20 tumor and adjacent normal tissue samples. Mrna expression of TAp73 and ΔNp73 was measured by real- time PCR, while the methylation profile of promoters P1 and P2 was examined by methylation-specific PCR (MSP). Methylation analysis showed that P1 promoter was unmethylated in all normal and malignant samples, while TAp73 expression levels were higher in 7/20 (35%), lower in 3/20 (15%) and normal in 10/20 (50%) tumor specimens. On the contrary, P2 promoter was methylated in 10/20 (50%), unmethylated in 2/20 (10%) and unmethylated only in the tumor specimen in 6/20 (30%) samples, respectively. This finding was in accordance with ΔNp73 mRNA expression, since ΔNp73 was not expressed in 10/20 (50%) samples, while in 7/20 (35%) samples it was only expressed in the tumor specimen. From the above results we deduce that the demethylation of P2 promoter and the subsequent expression of ΔΝp73 in tumor specimens is a key event in the development and progression of endometrial cancer.

Η πρωτεΐνη p63 παίζει σημαντικό ρόλο σε αρκετές ενδοκυτταρικές διεργασίες, όπως η ενεργοποίηση της μεταγραφής και η απόπτωση. Το γονίδιο p63 έχει δύο αμινοτελικές ισομορφές, τις TAp63 και ΔNp63. Οι TAp63 ισομορφές έχουν παρόμοιες λειτουργίες με την p53, ενώ οι ΔNp63 ισομορφές λειτουργούν ανασταλτικά και θεωρούνται ογκογόνες. Παρόλο που η p63 και οι ισομορφές της υπερεκφράζονται σε ευρύ φάσμα ανθρώπινων νεοπλασιών, όπως οι καρκίνοι του τραχήλου της μήτρας, του μαστού και του πνεύμονα, ο ρόλος τους στον καρκίνο του ενδομητρίου δεν έχει ακόμη διερευνηθεί. Μετρήσαμε με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (qPCR) την έκφραση του mRNA των ισομορφών TAp63 και ΔNp63 σε καρκινικά και παρακείμενα φυσιολογικά δείγματα 20 ασθενών με αδενοκαρκίνωμα ενδομητρίου. Αναγνωρίστηκε υπερέκφραση της TAp63 και ΔNp63 ισομορφής στα καρκινικά δείγματα κατά 1.8 και 4.3 φορές, αντίστοιχα. Περαιτέρω ανάλυση έδειξε ότι η αναλογία των ισομορφών ΔN/TA μετατοπίστηκε από 0.5 στα φυσιολογικά δείγματα στο 1.2 στα καρκινικά δείγματα. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι η έκφραση της TAp63 ισομορφής σχετίζεται με υψηλό δείκτη μάζας σώματος (p=0.034), με καθυστερημένη έναρξη της εμμηνόπαυσης (p=0.020) και με όγκους μέσης και υψηλής διαφοροποίησης (p=0.034). Η έκφραση της ΔNp63 ισομορφής σχετίζεται επίσης με όγκους μέσης και υψηλής διαφοροποίησης (p=0.044). Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι και οι δύο αμινοτελικές ισομορφές της πρωτεΐνης p63, και ιδιαίτερα η ΔNp63, πιθανά κατέχουν σημαντικό ρόλο στην εμφάνιση και εξέλιξη των αδενοκαρκινωμάτων ενδομητρίου μέσης και υψηλής διαφοροποίησης, ιδιαίτερα σε παχύσαρκες και καθυστερημένης εμμηνόπαυσης γυναίκες. Η πρωτεΐνη p73 παίζει σημαντικό ρόλο στις αναπτυξιακές διεργασίες του ανθρώπινου οργανισμού. Οι υποκινητές του γονιδίου P1 και P2 παράγουν δύο διαφορετικές ισομορφές, τις TAp73 και ΔΝp73, αντίστοιχα. Η TAp73 έχει παρόμοιες λειτουργίες με την p53, ενώ η ΔNp63 λειτουργεί ως αναστολέας των διεργασιών αυτών. Η p73 υπερεκφράζεται σε ανθρώπινες νεοπλασίες, όπως ο καρκίνος του μαστού, του πνεύμονα, και των ωοθηκών, αλλά ο ρόλος της στον καρκίνο του ενδομητρίου δεν έχει διερευνηθεί. Χρησιμοποιήθηκαν καρκινικοί και παρακείμενοι φυσιολογικοί ιστοί 20 ασθενών με αδενοκαρκίνωμα ενδομητρίου. Η έκφραση του mRNA των Tap73 και ΔNp73 μετρήθηκε με Real-Time PCR (qPCR), ενώ η μεθυλίωση των υποκινητών P1 και P2 εξετάσθηκε με methylation-specific PCR (MSP). Ο υποκινητής P1 δεν ήταν μεθυλιωμένος ούτε στα φυσιολογικά ούτε στα καρκινικά δείγματα, ενώ τα επίπεδα έκφρασης της TAp73 ισομορφής ήταν αυξημένα στο 35% και μειωμένα στο 15% των καρκινικών δειγμάτων, αντίστοιχα. Αντιθέτως, ο υποκινητής P2 ήταν μεθυλιωμένος στο 50% των δειγμάτων και μη-μεθυλιωμένος μονό στον καρκινικό ιστό σε 6/20 (30%) δείγματα. Το αποτέλεσμα αυτό είναι σε συμφωνία με την έκφραση της ΔNp73 ισομορφής, η οποία δεν εκφράζεται στο 50% των δειγμάτων, ενώ σε 7/20 (35%) δείγματα εκφράζεται μόνο στον καρκινικό ιστό. Η στατιστική ανάλυση αποκάλυψε ότι η απομεθυλίωση του P2 υποκινητή σχετίζεται με εμφάνιση της νόσου σε μικρότερη ηλικία (56.2±3.9 έναντι 64.3±2.1 έτη, p=0.048). Παρόμοια, η έκφραση της ΔNp73 ισομορφής σχετίζεται θετικά με εμφάνιση της νόσου σε ασθενείς ηλικίας <60 έτη (p=0.035). Η απομεθυλίωση του υποκινητή P2 και η επακόλουθη έκφραση της ΔΝp73 ισομορφής πιθανά κατέχει σημαντικό ρόλο στην εμφάνιση και εξέλιξη του καρκίνου του ενδομητρίου.