Έκφραση των γονιδίων HIF και των ρυθμιστών τους PHD και VHL σε πλακούντες εγκύων με ενδομήτρια υπολειπόμενη εμβρυϊκή ανάπτυξη (FGR)

Abstract

This project aims at revealing the possible connection between expression of Hypoxia Inducible Factors (HIF) and their pathway in pregnancies affected with Fetal Growth Restriction (FGR) together or not with preeclampsia. FGR is a complex condition in the field of current Obstetrics. The failure of a foetus to achieve its genetically determined growth potential is associated with significantly increased perinatal morbidity and mortality as well as being a major determinant of cardiovascular disease and glucose intolerance in adult life. FGR is not a disease entity with a unique pathophysiology. The term FGR is generally used for a foetus that presents reduced velocity pattern of growth (<10th centile). A variety of factors have been involved in this situation including infectious, congenital abnormalities, drug abuse or chemical substances, abnormalities of the placenta, immunological and anatomical factors. In most cases, however, incomplete placentopoiisis (placental formation) is the cause for the insufficient supply of nutritious substances and oxygen to the fetus that subsequently causes the deceleration of his growth. Hypoxia appears to constitute a common pathophysiological mechanism in almost the majority of the cases, and regardless the underlying pathology leads to the delay of fetal growth. Preeclampsia comprises a pathologic condition that, as many others, may cause foetus hypoxia. Preeclampsia affects 4-6% of pregnancies and it may have serious consequences for the maternal health as well as for the development and well-being of the foetus. This pathological entity is characterized by an increase of the arterial pressure beyond the 20th week of gestation as well as by proteinuria and/or oedema. Although a variety of conditions (including chronic hypertension, coagulopathies, immunological and genetic disorders, nutrition insufficiencies or abuses) appear to constitute risk factors and have been connected with higher risk of the disease; however, the molecular mechanisms and the precise causes that are hidden in the underlying pathophysiology remain unclear and raise a field of further investigation. Base on the studies of last decade, it has been revealed that the disturbance in the balance of circulating angiogenic factors (sFlt-1, VEGF1, PlGF) has an important role in the pathophysiology of preeclampsia that leads to endothelium abnormalities of vessels as well as to the symptoms of the disease. These factors are regulated by several other factors and conditions, but hypoxia seems to be one of the most important. One of the more important processes at the development of gestation is the physiologic formation of the fetal-placental unit that begins with the infiltration of cytotrophoblasts into the endometrium and is completed when conjunction with the spiral arteries has occurred. During this process, structural changes are required both for the endothelium of endometrium that receives cytotrophoblasts invasion and for the elastic walls of spiral arteries. This process includes the passage from a hypoxia condition into a condition of physiologic oxygenation in a cellular level; in this process the role of Hypoxia Inducible Factors (HIF) is critical. HIF-1 constitutes probably the most essential response of the cell to the hypoxia. It acts in the cell nucleus, by inducing the expression of many genes that play role in angiogenesis, cell cycle and metabolism. HIF- 2 appears to have a similar function, while the data regarding HIF-3 are still insufficient. As the regulation of these factors is depending on the oxygen concentration, a clear relationship is obvious between them and the hypoxia conditions of as FGR and preeclampsia. The regulation of HIF appears to relate not only with the induction/suspension of their expression, but also post-translationally with their degradation. Factors PHD-1, 2 and 3, as well as VHL play a role of their degradation. In some pathological situations, this model is probably disturbed and hypoxia maintains the regulating action of HIF in active levels. It is obvious that all the above factors appear to possess a critical role in the process of pathogenesis of both FGR and preeclampsia. The adequate comprehension of the pathway of regulation of HIF may give an impulse to development of intervention models in those particular pathologic conditions that are related with hypoxia, common in many pregnancies. ANXA5 is also crucial for the uteroplacental unit due to its antithrombotic action. During this study the action and regulation of the above mentioned factors (HIF-1a,-2a,-3a, ARNT, PHD-1,-2,-3, VHL and ANXA5) was investigated in term placentas from 49 FGR gestations related or not to preeclampsia compared to 30 term placentas from normal pregnancies. FGR and preeclampsia were diagnosed with clinical and laboratory data and cases with particular pathological cause such as thrombophilia, chromosomal defects, infections and others were excluded. All placentas were examined by a pathologist. RT-PCR was the molecular technique of choice to determine expression profiles for each gene. Western blotting and immunohistochemistry was also performed in selected cases. Statistical analysis was processed with the use of SPSS software. The final results revealed marked downregulation of PHD-2, PHD-3 and ANXA5, slight upregulation of HIF-1a and HIF-2a, along with PHD-1, while ARNT, HIF-3a and VHL expressions didn’t produce significant differences between FGR and normal placentas. ANXA5 was expected to be downregulated, since placentas from FGR and preeclamptic pregnancies showed infarcts presence. Downregulation of PHD-2 and PHD-3, along with upregulation of HIF-1a and HIF-2a points out the inducible effect that hypoxia seems to have in HIF transcriptional pathway. Stabilization of HIF-a subunits by reduction of PHD proteins is more crucial for activation of HIF than HIF expression by itself. Moreover, with the clinical and demographic data correlation analysis along with expression profiles, a new model is introduced. Based on these results, it can be hypothesized that FGR babies with less severe disease, are able to produce a signal stimulated by the reduced placental nutrient and oxygen availability in order to overcome it, in contrast to FGR babies with a more adverse outcome that fail to produce this signal. This adaptation model is evident through the different expression pattern of the genes examined.

Σκοπός του προτεινόμενου ερευνητικού έργου αποτέλεσε η διερεύνηση της πιθανής συσχέτισης της έκφρασης παραγόντων σχετιζόμενων με υποξικές καταστάσεις σε πλακούντες από τελειόμηνες εγκυμοσύνες με εμβρυική υπολειπόμενη ανάπτυξη (ΕΥΑ) σε έδαφος ή μη προεκλαμψίας. Η ενδομήτρια υπολειπόμενη εμβρυϊκή ανάπτυξη (EYA) είναι ένα σύνθετο πρόβλημα στη σύγχρονη μαιευτική. Η αποτυχία του εμβρύου να φτάσει στο γενετικά καθορισμένο αναπτυξιακό του πρότυπο, συνδέεται με σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα, ενώ παράλληλα αποτελεί καθοριστικό παράγοντα καρδιοαγγειακών παθήσεων και μεταβολικών διαταραχών στην ενήλικο ζωή. Πολλοί αιτιολογικοί παράγοντες έχουν ενοχοποιηθεί για την ΕΥΑ, ωστόσο στις περισσότερες περιπτώσεις είτε η πρωτοπαθής ανώμαλη πλακουντοποίηση είτε η δευτεροπαθής βλάβη του πλακούντα είναι υπεύθυνη για την ανεπαρκή προσφορά θρεπτικών ουσιών και οξυγόνου στο έμβρυο που οδηγεί στην επιβράδυνση της ανάπτυξής του. Επομένως, στον παθοφυσιολογικό μηχανισμό φαίνεται να συμμετέχει η υποξία, η οποία επίσης συσχετίζεται με μια σειρά παθολογικών καταστάσεων της κύησης συμπεριλαμβανομένης της προεκλαμψίας. Η προεκλαμψία εμφανίζεται στο 4-6% των κυήσεων και μπορεί να έχει σοβαρές επιπτώσεις στην υγεία της μητέρας και στην ανάπτυξη του εμβρύου. Πρόκειται για μία νόσο που χαρακτηρίζεται από αύξηση της αρτηριακής πίεσης μετά την 20η εβδομάδα της κύησης σε συνδυασμό με πρωτεϊνουρία ή/και οίδημα. Με βάση μελέτες της τελευταίας δεκαετίας, αποκαλύπτεται ότι σημαντική συμμετοχή στην παθοφυσιολογία της προεκλαμψίας έχει η διαταραχή στην ισορροπία των κυκλοφορούντων αγγειογενετικών παραγόντων sFlt-1 (soluble vascular endothelial growth factor receptor- 1), VEGF1 (vascular endothelial growth factor-1) και PlGF (placenta growth factor), που οδηγεί σε ανωμαλίες του ενδοθηλίου των αγγείων και σε δεύτερο χρόνο στα κλινικά συμπτώματα της νόσου (θεωρία δύο σταδίων). Οι παράγοντες αυτοί ρυθμίζονται από διάφορες παραμέτρους, σημαντική εκ των οποίων, είναι και η υποξία. Μία από τις βασικότερες διαδικασίες κατά την εξέλιξη μιας κύησης είναι η φυσιολογική δημιουργία της εμβρυοπλακουντιακής μονάδας, που ξεκινάει με τη διείσδυση της κυτταροτροφοβλάστης στο ενδομήτριο, ενώ στη συνέχεια ολοκληρώνεται με τη συνένωση με τα μητριαία σπειροειδή αγγεία. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας αυτής απαιτούνται δομικές αλλαγές τόσο στο ενδομήτριο που υποδέχεται την κυτταροτροφοβλάστη, όσο και στα μυϊκά κυρίως τοιχώματα των μητριαίων σπειροειδών αρτηριών με σκοπό τη δημιουργία των χοριακών λαχνών. Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει τη μετάβαση από συνθήκες υποξίας σε συνθήκες φυσιολογικής οξυγόνωσης σε κυτταρικό επίπεδο και επομένως απαιτεί τη σημαντική συμμετοχή των επαγόμενων από την υποξία ρυθμιστικών παραγόντων HIF. Ο παράγοντας HIF-1 κατέχει βασικό ρόλο στο μηχανισμό «απάντησης» του κυττάρου σε καταστάσεις υποξίας. Δρα στον πυρήνα του κυττάρου επάγοντας την έκφραση πολλών πρωτεϊνών που διαδραματίζουν ρόλο στην αγγειογένεση, τον κυτταρικό κύκλο και το μεταβολισμό. Παρόμοια λειτουργία φαίνεται να διαδραματίζει και o HIF-2, ενώ για τον HIF-3 τα δεδομένα είναι ελλιπή. Ο τρόπος ρύθμισης των HIF φαίνεται να μη σχετίζεται μόνο με την επαγωγή/αναστολή της έκφρασής τους, αλλά και μετα-μεταφραστικά (posttranslationally) με την αποδόμηση των HIF-a υπομονάδων τους, στην οποία ρόλο έχουν οι παράγοντες PHD-1, 2 και 3, καθώς και ο VHL. Σε υποξικές καταστάσεις όμως, η χαμηλή PO2 αναστέλλει την υδροξυλίωση της HIF-a υπομονάδας από τους PHD και την ακόλουθη πρωτεασωμική αποδόμησή της με τη συμμετοχή του VHL, με συνέπεια τη σταθεροποίησή της και τη δημιουργία του ετεροδιμερούς HIF μετά από την ένωση με τον HIF-b (ARNT) και τη μεταγραφική ενεργοποίηση. Ο καταρράκτης (cascade) γεγονότων που ακολουθεί είναι κρίσιμος, αν συνυπολογίσει κανείς τον αριθμό και το ρόλο των γονιδίων στόχων των HIF (αγγειογένεση, κυτταρικός κύκλος, μεταβολισμός). Φαίνεται λοιπόν ότι οι παραπάνω παράγοντες (HIF, PHD, VHL), ρυθμίζονται ανάλογα με τη μερική τάση του οξυγόνου, γεγονός που τους συνδέει άμεσα με καταστάσεις υποξίας, όπως πιθανότατα συμβαίνει στην εμβρυοπλακουντιακή κυκλοφορία σε εγκυμοσύνες με ΕΥΑ και προεκλαμψία. Η αννεξίνη V (ANXA5) είναι μία άλλη πρωτεΐνη, η έκφραση της οποίας φαίνεται να είναι σημαντική στην εμβρυοπλακουντιακή κυκλοφορία. Η αντιθρομβωτική της δράση, την καθιστά αναγκαία στη διατήρηση της καλής αιματικής κυκλοφορίας, ενώ μειωμένα επίπεδα μπορεί να αποτελέσουν παράγοντα θρομβωτικών επεισοδίων στα αγγεία του χοριακού πλέγματος. Στην παρούσα μελέτη ανιχνεύτηκε η έκφραση των παραπάνω γονιδίων (HIF-1, HIF-2, HIF-3, ARNT, PHD-1, PHD-2, PHD-3, VHL και ΑΝΧΑ5) σε πλακουντιακό ιστό από 49 κυήσεις που εμφάνισαν ΕΥΑ σε έδαφος προεκλαμψίας ή ανεξάρτητα από αυτήν και από 30 κυήσεις με ομαλή πορεία και γέννηση ικανοποιητικού βάρους για την ηλικία κύησης νεογνού. Η παρουσία προεκλαμψίας και η ΕΥΑ επιβεβαιώθηκαν με κλινικά-εργαστηριακά και υπερηχογραφικά κριτήρια αντίστοιχα, ενώ αποκλείστηκαν οι περιπτώσεις ΕΥΑ που αποδόθηκαν σε συγκεκριμένη νοσολογική οντότητα (θρομβοφιλία, ανοσολογικά και γενετικά αίτια, λοιμώξεις κ.ά). Όλοι οι πλακούντες εξετάστηκαν ιστοπαθολογικά. Για τον προσδιορισμό της έκφρασης των υπό εξέταση γονιδίων έγινε αρχικά εξαγωγή εκχυλίσματος RNA από τα δείγματα και στη συνέχεια Real Time PCR. Επίσης επιλεκτικά έγινε εξαγωγή εκχυλίσματος πρωτεϊνών από τα δείγματα και στη συνέχεια western blotting με φθορίζοντα αντισώματα. Για την ανοσοϊστοχημική ανίχνευση έγινε μονιμοποίηση των δειγμάτων σε παραφίνη και μετά ανοσοϊστοχημική χρώση με ειδικά για την πρωτεΐνη μονοκλωνικά αντισώματα. Η ανάλυση για την εξαγωγή στατιστικής σημαντικότητας πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό SPSS και την εφαρμογή πολυπαραγοντικής ανάλυσης με τη χρήση μη παραμετρικών δοκιμασιών (Kruskal-Wallis test, Mann-Whitney test). Τα αποτελέσματα της έκφρασης των γονιδίων έδειξαν σημαντική μείωση για τα γονίδια PHD-2, PHD-3 και ANXA5, μερική αύξηση της έκφρασης των γονιδίων HIF-1a και HIF-2a, καθώς και του PHD-1, ενώ τα γονίδια ARNT, HIF-3a και VHL δεν έδειξαν ιδιαίτερα σημαντικές μεταβολές σε σχέση με τα φυσιολογικά δείγματα. Η ANXA5 έχει σαφώς μειωμένη έκφραση στην υπολειπόμενη ανάπτυξη και στην προεκλαμψία, γεγονός που δικαιολογεί την παρουσία περισσότερων θρόμβων στους πλακούντες των γυναικών με αυτές τις παθολογίες. Οι παράγοντες HIF φαίνεται να συμμετέχουν στην παθοφυσιολογία της εκδήλωσης IUGR κυρίως μέσω της μείωσης στην έκφραση του PHD-2 και του PHD-3, αλλά και με τη μικρή αύξηση των HIF-1a και HIF-2a. Η ρύθμιση των HIF είναι κυρίως μετα-μεταγραφική και η ελάττωση των παραγόντων αποδόμησής τους (PHD) αποτελεί σημαντικό κλειδί της ενεργοποίησης των HIF προς το δικό τους μεταγραφικό ρόλο. Επιπρόσθετα, από τις συσχετίσεις που προέκυψαν με διάφορες κλινικοεργαστηριακές και σωματομετρικές παραμέτρους μπορεί να υποστηριχθεί η ύπαρξη ενός μοντέλου κεντρικής απάντησης του εμβρύου μέσω παραγωγής παραγόντων από τον πλακούντα. Με βάση την παραπάνω θεωρία, στις κυήσεις με ΕΥΑ τα έμβρυα με καλύτερο προφίλ ανάπτυξης παρουσίασαν διαφορετικό πρότυπο μεταβολών στην έκφραση των μελετώμενων γονιδίων, σε σχέση με τα έμβρυα χειρότερης πρόγνωσης, εύρημα που υποδηλώνει τη δημιουργία απάντησης ή την αδυναμία απάντησης αντίστοιχα, στην υποξική αιτία που προκάλεσε ή συμμετείχε στην ενδομήτρια καθυστέρηση της ανάπτυξης.