Αξιολόγηση πειραματικών / υπολογιστικών παραμέτρων λιποφιλίας σε ποσοτικές σχέσεις δομής-δράσης και εκτίμηση φαρμακοκινητικών διεργασιών στη βάση βιοχρωματογραφικών δεικτών: εφαρμογή σε όξινα παράγωγα του πυρρολίου, αναστολείς της αναγωγάσης της αλδόζης

Abstract

The present thesis consists of two sections: In the first section the lipophilicity of a series of pyrrolyl-acetic acid derivatives, inhibitors of the aldose reductase enzyme was assessed by direct partitioning experiments in the n-octanol-water system at pH 3.0 and 7.4. Distribution coefficients concerning both the neutral and the anionic species were compared to calculated values generated by commonly used software. The consistency of the predictions was evaluated, as well as the reliability between experimental and predicted logP or logD values. Divergences in values provided by the different calculation systems and rather low predictivity in respect to the experimental values were observed. The application of calculated values to relationships with aldose reductase inhibitory activity did not show any tendency of the data, while the experimental logP values proved more suitable for correlation with biological activity, and combined with polarity or electronic terms succeeded in satisfactory QSAR equations. Taken into consideration the necessity of experimental lipophilicity data, reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and reversed phase thin layer chromatography (RP-TLC) were also used as rapid and friendly techniques. In the case of RP-HPLC an ABZ+ column was used as a stationary phase, which is considered to show reduced silanophilic interactions. Extrapolated retention factors, logkw, were assessed at pH 3.0 and 7.4 under different mobile phase conditions in order to improve the simulation of the octanol-water system. The addition of a small amount of n-octanol to the volume of methanol proved a crucial factor in this direction. The individual models for the logkw/logP or logD correlation, although with moderate statistics proved to be more reliable in predicting the logP (or logD) values of the pyrrolyl-acetic acid derivatives compared to the general reference equation established for structurally different acidic drugs. The logkw values determined at pH 3.0 in presence of 0.05% octanol in the mobile phase proved more suitable to replace the logP parameter in correlation with aldose reductase inhibitory activity. However variations in the regression coefficients and in respect to outliers indicate that the information content of chromatographic indices is not strictly identical to that of logP values. The study of lipophilicity by RP-TLC has focused on investigating the effect of stationary phase using RP-C18 and RP-C8 plates. RMw values were assessed at pH 7.4. It turned out that the ionization affects the retention in case of pyrrolyl-carboxylic acids despite opposite references in literature and the RP-C8 stationary phase is a more appropriate choice compared to the most commonly used RP-C18 stationary phase both in the simulation of lipophilicity and the relationship with the biological activity. However combination of RMw(C8) και RMw(C18) with additional parameters correlate equally well with the biological activity.The second part of the thesis focuses on biomimetic chromatography and affinity chromatography using stationary phases IAM, HSA and AGP. The study of derivatives of pyrrolyl-acetic acid and difluorophenol derivatives was extended using IAM chromatography at pH 3.0 and 7.4. IAM chromatographic indices were compared with the conventional parameters of lipophilicity and relevant correlations were established. In addition, the pyrrole derivatives were used as test set for the validation of a standard equation suggested for the prediction of IAM indices based on their logD values. A good fit of the new derivatives was found, while the model equation was further improved by the introduction of the indicator variable I for the presence of carboxylic anion. The IAM indices of the pyrrole derivatives were also compared with the corresponding reversed phase HPLC and TLC retention factors. The retention profile of representative derivatives in IAM column as a function of pH (in the range from 2.5 to 7.4) was investigated and compared with the corresponding profiles obtained by HPLC and octanol-water partition system. In order to generate standard equations/models for estimating the gastrointestinal absorption logkwIAM of structurally diverse compounds, lipophilicity data (logD) and permeability values in MDCK cell lines (logPerm) taken from literature were utilized. A saturation curve was found between %HOA values and logkwIAM, logD and logPerm values, whereas certain lower limits values could be defined above which %HOA is practically 100%. The models were improved upon introduction of the hydrogen bond basicity parameter of Abraham and molecular fraction F+, as an expression of the electrostatic effects. It was found that such electrostatic interactions are overexpressed in the IAM stationary phase, while they are partially expressed in the permeability of the cell line MDCK. Nevertheless, the contribution of these interactions in gastrointestinal absorption is advocated by the statistical significance and the positive sign of the term F+ in the corresponding model established using the logD values. With regard to affinity chromatography the retention behavior of structurally diverse drugs was determined on stationary phases which incorporate immobilized human plasma albumin and alpha-acid glycoprotein (columns HSA and AGP). Different conditions in respect of pH and organic modifier were tried, using acetonitrile and 2-propanol. A significant influence of the nature and percentage of organic modifier in AGP retention was observed, and further investigation is necessary to clarify the retention mechanism. To this direction solvatochromic analysis was applied in order to investigate the factors that affect retention on both HSA and AGP columns. HSA and AGP chromatography was further used to study the retention behavior of the pyrrole derivatives. A strong affinity of the pyrrolyl-acetic acid derivatives for the HSA column was observed in analogy with their behavior in reversed phase ABZ+ stationary phaseHSA chromatographic indices were used to simulate plasma protein binding data. The isocratic logk10HSA(ACN) values proved to be most suitable for estimating %PPB and were used to establish a reference equation. The reference equation was successfully validated with a test set. It was further observed that logk10HSA(ACN) values >1,85 lead to practically 100% protein binding. Less successful was the correlation of the AGP chromatographic indices with association constants on two variants of alpha-acid glycoprotein (variant A and mix F1*S), while variations in the equations obtained with different AGP chromatographic indices were observed, as a consequence of the effect of organic modifier in AGP retention. In order to further investigate the similarities/dissimilarities between the different chromatographic systems and the octanol-water partition system Principal Component Analysis (PCA) was performed successively on the structurally diverse drugs, the pyrrole derivatives and the combined set of compounds. The difference between PCA models reflects the strong influence of the distinct behavior of the pyrrolyl-acetic acid derivatives, which leads to reversal positions of the HSA and AGP variables in the loading plot. Finally, the biochromatographic indices of the pyrrole derivatives were introduced in the proposed standard equations for estimating their intestinal absorption, their protein binding and their volume distribution. %ΗΟΑ values higher than the proposed limit of 90% for well-absorbed drugs after oral administration were assessed. Similarly, the protein binding ranges from 66-99% while the estimated volumes of distribution have small values. These data provide useful information to be considered in the further investigation of similar chemotypes, in combination with the aldose reductase inhibitory activity.

Η παρούσα διατριβή αποτελείται από δυο ενότητες:Στην πρώτη ενότητα πραγματοποιήθηκε διεξοδική μελέτη της λιποφιλίας σειράς υποκατεστημένων παραγώγων του πυρρολυλ-οξικού οξέος, τα οποία εμφανίζουν ανασταλτική δράση έναντι της αναγωγάσης της αλδόζης. Προσδιορίστηκαν οι συντελεστές μερισμού/κατανομής των παραγώγων αυτών σε pH 3,0 και 7,4 με την κλασική μέθοδο της ανακινούμενης φιάλης στο σύστημα οκτανόλης-νερού και συγκρίθηκαν με τιμές που προέκυψαν χρησιμοποιώντας διάφορα υπολογιστικά συστήματα. Διαπιστώθηκαν αποκλίσεις των τιμών μεταξύ των διαφορετικών υπολογιστικών συστημάτων και χαμηλή αξιοπιστία ως προς τις πειραματικές τιμές logP, η οποία μειώθηκε περαιτέρω κατά τη σύγκριση των τιμών logD7,4 που αφορούν στις ιονισμένες μορφές των ενώσεων. Η εφαρμογή υπολογιστικών τιμών οδήγησε σε απόκρυψη της σχέσης της ανασταλτικής δράσης επί της αναγωγάσης της αλδόζης με τη λιποφιλία και στην αδυναμία εξαγωγής ικανοποιητικών Ποσοτικών Σχέσεων Δομής-Δράσης. Αντίθετα οι πειραματικές τιμές αποδείχθηκαν καταλληλότερες για τη συσχέτιση της βιολογικής δράσης, ιδιαίτερα αν συνδυαστούν με όρους που εκφράζουν την πολικότητα ή ηλεκτρονιακές ιδιότητες.Για τον προσδιορισμό της λιποφιλίας χρησιμοποιήθηκαν επίσης η αντιστρόφου φάσεως υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (RP-HPLC) και η αντιστρόφου φάσεως χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (RP-TLC), η οποίες αποτελούν γρήγορες και φιλικές προς το χρήστη εναλλακτικές τεχνικές. Στην περίπτωση της RP-HPLC ως στατική φάση χρησιμοποιήθηκε στήλη ABZ+, η οποία θεωρείται ότι εμφανίζει μειωμένες σιλανόφιλες αλληλεπιδράσεις. Οι τιμές logkw, προσδιορίστηκαν σε pΗ 3,0 και 7,4, υπό διαφορετικές χρωματογραφικές συνθήκες κινητής φάσης στην προσπάθεια βελτίωσης της προσομοίωσης με το σύστημα οκτανόλης-νερού. Η προσθήκη μικρής ποσότητας οκτανόλης στη μεθανόλη αποδείχθηκε κρίσιμος παράγοντας προς αυτή την κατεύθυνση. Τα επιμέρους μοντέλα αν και με μέτρια στατιστικά στοιχεία αποδείχτηκαν περισσότερο αξιόπιστα στην πρόβλεψη των συντελεστών κατανομής των παραγώγων του πυρρολυλ-οξικού οξέος συγκριτικά με τις γενικές εξισώσεις αναφοράς. Οι τιμές logkw των αδιάστατων μορφών που προσδιορίστηκαν παρουσία 0,05% οκτανόλης στην κινητή φάση σε pH 3,0 αποδείχτηκαν καταλληλότερες για να αντικαταστήσουν τις τιμές logP στις συσχετίσεις με την αναστολή της αναγωγάσης της αλδόζης. Ωστόσο διαφοροποιήσεις ως προς το συντελεστή παλινδρόμησης και τις ενώσεις με αποκλίνουσα συμπεριφορά υποδηλώνουν ότι το πληροφοριακό περιεχόμενο των χρωματογραφικών δεικτών δεν είναι απόλυτα ταυτόσημο με αυτό των τιμών logP.Η μελέτη της λιποφιλίας με RP-TLC εστιάστηκε στη διερεύνηση της επίδρασης της στατικής φάσης στη συγκράτηση. Οι τιμές RMw προσδιορίστηκαν σε pH 7,4. Αποδείχθηκε ότι ο ιονισμός επηρεάζει τη συγκράτηση στην περίπτωση των πυρρολυλ-καρβοξυλικών οξέων και η στατική φάση σιλανοποιημένη με οκτώ άτομα άνθρακα (RP-C8) αποτελεί καταλληλότερη επιλογή συγκριτικά με την RP-C18 στατική φάση τόσο όσον αφορά στην προσομοίωση της λιποφιλίας όσο και στη συσχέτιση με τη βιολογική δράση. Παρόλα αυτά αν οι τιμές RMw(C8) και RMw(C18) συνδυαστούν με επιπλέον παραμέτρους συσχετίζονται εξίσου ικανοποιητικά με τη βιολογική δράση και τους χρωματογραφικούς δείκτες.Η δεύτερη ενότητα εστιάζεται στη βιομιμητική χρωματογραφία και τη χρωματογραφία συγγένειας, χρησιμοποιώντας στατικές φάσεις ΙΑΜ, HSA και AGP.Η μελέτη των παραγώγων του πυρρολυλ-οξικού οξέος και παραγώγων διφθοροφαινόλης επεκτείνεται χρησιμοποιώντας χρωματογραφία ΙΑΜ σε pH 3,0 και 7,4. Οι χρωματογραφικοί δείκτες ΙΑΜ συγκρίνονται με τις συμβατικές παραμέτρους λιποφιλίας και εξάγονται οι επιμέρους συσχετίσεις. Επιπλέον τα παράγωγα του πυρρολίου χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα ελέγχου για την πρότυπη εξίσωση πρόβλεψης δεικτών ΙΑΜ με βάση τις τιμές logD. Διαπιστώθηκε καλή προσαρμογή των νέων παραγώγων στην πρότυπη εξίσωση, η οποία ωστόσο συμπληρώνεται με την παράμετρο-δείκτη Ι για την παρουσία των καρβοξυλικών ανιόντων, ενώ δεν μεταβάλλονται οι όροι και οι συντελεστές της εξίσωσης. Οι χρωματογραφικοί δείκτες ΙΑΜ των παραγώγων του πυρρολίου συγκρίθηκαν επιπλέον με τους αντίστοιχους δείκτες στην αντιστρόφου φάσεως HPLC και TLC. Διερευνήθηκε το προφίλ της συγκράτησης αντιπροσωπευτικών ενώσεων στη στήλη ΙΑΜ συναρτήσει του pH (σε εύρος από 2,5 έως 7,4) και συγκρίθηκε με το αντίστοιχο προφίλ που λαμβάνεται στην αντιστρόφου φάσεως χρωματογραφία και στην κατανομή στο σύστημα οκτανόλης-νερού. Παρατηρήθηκε σταθεροποίηση των τιμών logkwΑΒΖ σε pH>5 σε αρκετά υψηλότερες τιμές από τις αντίστοιχες τιμές logD. Στη χρωματογραφία ΙΑΜ τα προφίλ logkwIAM/pH είχαν γραμμική μορφή βρισκόμενα χαμηλότερα από τα αντίστοιχα προφίλ στη στήλη ABZ+ εμφανίζοντας μικρή καμπύλωση σε pH 7,4.Για την εξαγωγή μοντέλων/προτύπων εξισώσεων με στόχο την εκτίμηση της γαστρεντερικής απορρόφησης αξιοποιήθηκαν βιβλιογραφικές τιμές logkwIAM δομικώς διαφορετικών ενώσεων, τιμές λιποφιλίας (logD) και τιμές διαπερατότητας σε κυτταρικές σειρές MDCK (logPerm). Διαπιστώθηκε καμπύλη κορεσμού μεταξύ των τιμών %HOA και των τιμών logkwIAM, logD και logPerm, σύμφωνα με την οποία πάνω από κάποια όρια τιμών η %HOA είναι πρακτικά 100%. Τα μοντέλα βελτιώνονται με την εισαγωγή της βασικότητας σε δεσμούς υδρογόνου και του μοριακού κλάσματος F+, ως έκφρασης των ηλεκτροστατικών επιδράσεων. Διαπιστώθηκε ότι οι αλληλεπιδράσεις αυτές υπερεκφράζονται στη στατική φάση ΙΑΜ, ενώ εκφράζονται μερικώς στη διαπερατότητα από τις κυτταρικές σειρές MDCK. Η συμβολή ωστόσο των αλληλεπιδράσεων αυτών στη γαστρεντερική απορρόφηση οδηγεί στη σημαντικότητα του όρου F+ στο μοντέλο που εξάγεται με τις τιμές logD, όπου συμμετέχει με θετικό πρόσημο. Όσον αφορά στη χρωματογραφία συγγένειας μελετήθηκε διεξοδικά η συγκράτηση σειράς δομικώς διαφορετικών ενώσεων σε στατικές φάσεις που ενσωματώνουν την ανθρώπινη αλβουμίνη του ορού και την α-όξινη γλυκοπρωτεΐνη του πλάσματος (στήλες HSA και AGP) υπό διαφορετικές συνθήκες όσον αφορά στο pH και στον οργανικό τροποποιητή, χρησιμοποιώντας ακετονιτρίλιο και ισοπροπανόλη. Διαπιστώθηκε μεγαλύτερη επίδραση της φύσης και του ποσοστού του οργανικού τροποποιητή στη στατική φάση AGP, γεγονός που χρήζει περαιτέρω διερεύνησης. Επιπλέον εφαρμόστηκε σολβατοχρωμική ανάλυση για τη διερεύνηση των παραγόντων που επηρεάζουν τη συγκράτηση. Αντίστοιχα μελετήθηκαν και τα παράγωγα του πυρρολίου. Σε ότι αφορά τη χρωματογραφία HSA οι ισοκρατικές τιμές logk10HSA(ACN) αποδείχθηκαν ως οι πλέον κατάλληλες για την εκτίμηση της πρωτεϊνικής σύνδεσης και χρησιμοποιήθηκαν για την εξαγωγή εξίσωσης αναφοράς. Η εξίσωση αναφοράς αξιολογήθηκε στη συνέχεια επιτυχώς με σειρά ελέγχου. Παρατηρήθηκε ότι οι τιμές logk10HSA(ACN)>1,85 οδηγούν σε τιμές πρωτεϊνικής σύνδεσης πρακτικά 100%. Οι χρωματογραφικοί δείκτες AGP συσχετίστηκαν με σταθερές σύνδεσης σε δυο παραλλαγές της α-όξινης γλυκοπρωτεΐνης (παραλλαγή Α και μίγμα F1*S). Δεν ελήφθησαν ικανοποιητικές συσχετίσεις, παρατηρήθηκαν δε διαφοροποιήσεις των εξισώσεων που ελήφθησαν με διαφορετικούς χρωματογραφικούς δείκτες AGP. Για την περαιτέρω διερεύνηση των ομοιοτήτων/ανομοιοτήτων μεταξύ των διαφορετικών χρωματογραφικών συστημάτων συγκριτικά και με την κατανομή στο σύστημα οκτανόλης-νερού χρησιμοποιήθηκε Ανάλυση Κυρίων Συνιστωσών (PCA), η οποία εφαρμόστηκε διαδοχικά στη σειρά δομικώς διαφορετικώς ενώσεων, στα παράγωγα του πυρρολίου και στο σύνολο των ενώσεων. Η διαφοροποίηση μεταξύ των μοντέλων PCA αντανακλά την ισχυρή επίδραση της διαφορετικής συμπεριφοράς των καρβοξυλικών ανιόντων στην περίπτωση των παραγώγων του πυρρολυλ-οξικού οξέος, η οποία οδηγεί σε αντιστροφή των θέσεων των δεικτών HSA και AGP στο διάγραμμα των φορτίων.Τέλος, οι βιοχρωματογραφικοί δείκτες που προσδιορίστηκαν για τα παράγωγα του πυρρολίου χρησιμοποιήθηκαν με βάση τις προτεινόμενες πρότυπες εξισώσεις για την εκτίμηση της γαστρεντερικής απορρόφησης, της πρωτεϊνικής σύνδεσης και του όγκου κατανομής. Εκτιμήθηκαν τιμές %ΗΟΑ μεγαλύτερες από το προτεινόμενο όριο του 90% για τα καλώς απορροφούμενα φάρμακα μετά από του στόματος χορήγηση. Αντίστοιχα, η πρωτεϊνική σύνδεση κυμαίνεται από 66-99%, ενώ οι προβλεπόμενοι όγκοι κατανομής εμφανίζουν μικρές τιμές. Τα στοιχεία αυτά αποτελούν χρήσιμες πληροφορίες για την περαιτέρω έρευνα ανάλογων χημειοτύπων, σε συνδυασμό με την ανασταλτική δράση επί της αναγωγάσης της αλδόζης.