Μοριακή ανάλυση σποραδικών καρκινωμάτων του παχέος εντέρου σε υλικό κυτταρολογίας υγρής φάσης ThinPrep

Abstract

The aim of this study was the molecular characterization of colon carcinomas collected and preserved in liquid based cytology ThinPrep® focused on identification of molecular fingerprints that could aid in decision-making of chemotherapy scheme. A total of 251 samples were collected. 107 paired samples from carcinomas and normal neighboring mucosa, 3 polyps, 9 adenomas and 25 carcinomas. Extracted nucleic-acids were quantified and checked for their integrity. Three TYMS polymorphisms that are connected to its protein expression were analyzed with PCR and RFLP. Promoter methylation status of the CDK2A, MLH1 and MGMT genes was evaluated with MSP Real-Time PCR with Scorpion primers was used for mutation detection of KRAS and EGFR genes. For BRAF and to verify the KRAS results samples were sent for sequencing. mRNA gene expression of EGFR, HER2 TOP1 and TOP2A genes normalized with three house-keeping genes was measured in selected samples with qPCR with dual labelled probe chemistry. Immunocytochemistry and western blot was recruited for validation of selected results. Finally, aneuploidies were detected with flow cytometry. The results clearly supported that ThinPrep® is an excellent choice of medium for collection and storage of samples that are to be analyzed with molecular techniques as amplification of large products from DNA and mRNA and aneuploidy detection was possible. Results for TYMS polymorphisms identified 18 different genotypes suggesting a much larger sample should be used to study their significance. Promoter DNA methylation was common finding for CKDN2A and MGMT less common for MLH1 and resulted in reduction or total loss of protein expression. KRAS and BRAF mutation were identified in accordance to international frequencies. Rare EGFR mutations were found though they seemed to be present only in a small portion of tumor cells. mRNA up-regulation was found in cancer samples for the products of TOP1 and TOP2A genes. In conclusion, ThinPrep® brushings allow the thorough analysis of molecular characteristics of colorectal carcinomas. In each patient's sample at least one molecular characteristic that could be used to group the patient as more likely to benefit from specific chemotherapeutic schemes. Due to the adding layers of complexity with each new characteristic further multi-centered studies are needed to collect and manage the vast amount of information.

Σκοπός της παρούσας εργασίας αποτέλεσε η μοριακή ανάλυση καρκινωμάτων παχέος έντερου σε υλικό κυτταρολογία υγρής φάσης ThinPrep®, Ειδικότερα, η εφαρμογή μοριακών τεχνικών για την ανίχνευση συγκεκριμένων χαρακτηριστικών του κάθε καρκινώματος που μπορούν χρησιμοποιηθούν στην απόφαση λήψης συγκεκριμένων χημειοθεραπευτικών. Συλλέχθηκαν 251 δείγματα, 107 ζεύξη δειγμάτων από καρκίνωμα και παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο, 3 πολύποδες, 9 αδενώματα και 25 καρκινώματα. Σε αυτά αφού πραγματοποιήθηκε έλεγχος των νουκλεϊκών οξέων που απομονώθηκαν ακολούθησε ανάλυση γενετικών πολυμορφισμών που καθορίζουν την έκφραση της θυμιδιλικής συνθάσης (TYMS) και χαρακτηρισμός της κατάστασης μεθυλίωσης του υποκινητή των γονίδιων MLH1, MGMT και CDKN2A (p16ΙΝΚ4Α). Σε καρκινώματα πραγματοποιήθηκε έλεγχος για την ύπαρξη μεταλλάξεων στα γονίδια KRAS, BRAF και EGFR. Σε επιλεγμένα ζεύγη δειγμάτων αναλύθηκε η γονιδιακή έκφραση των γονίδιων EGFR, HER2, ΤΟΡ1 και ΤΟΡ2Α κανονικοποιημένη ως προς γονίδια αναφοράς. Επιπλέον, ανοσοκυτταροχημεία και western πραγματοποιήθηκαν για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων. Τέλος, διερευνήθηκε η ύπαρξη ανευπλοειδίων με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα υποστηρίζουν πως το ThinPrep® αποτελεί εξαιρετική επιλογή για την λήψη και αποθήκευση δειγμάτων που προορίζονται για ανάλυση με τεχνικές μοριακής βιολογίας καθώς είναι εφικτός ο προσδιορισμός ανευπλοειδίων και ο πολλαπλασιασμός μεγάλων τμημάτων DNA και mRNA. Οι πολυμορφισμοί της TYMS κατατάσσουν τους ασθενείς σε 18 διαφορετικούς γονότυπους προτείνοντας την ανάγκη ανάλυση μεγαλυτέρου δείγματος για την ανάδειξη της σημασίας τους. Επιπλέον, η μεθυλίωση των υποκινητών των υπό μελέτη γονίδιων είναι πολύ συχνή για τα MGMT και CDKN2A και σπανιότερη για το MLH1. Η μεθυλίωση συνοδεύτηκε από απώλεια της πρωτεΐνης. Τα ποσοστά των μεταλλαγών του KRAS και BRAF συμβάδισαν με τα διεθνή πρότυπα. Επίσης, αν και σε λίγα κύτταρα του όγκου φαίνεται να υπάρχουν σπάνια μεταλλαγές στον EGFR. Αύξηση της μεταγραφής παρατηρείται για τα ΤΟΡ1 και ΤΟΡ2Α σε καρκινικά δείγματα. Συμπερασματικά, η λήψη υλικού από καρκινώματα του παχέος έντερου σε ThinPrep® καθιστά εφικτή την διεξοδική ανάλυση των μοριακών χαρακτηριστικών τους. Σε όλα τα δείγματα σχεδόν υπήρχε κάποιο μοριακό χαρακτηριστικό που κατέτασσε τον ασθενή σε κατηγορία που θα είχε όφελος από λήψη συγκεκριμένου χημειοθεραπευτικού πρωτοκόλλου. Λόγω της αυξανόμενης πολυπλοκότητας με την προσθήκη κάθε νέου χαρακτηριστικού είναι απαραίτητη οργάνωση πολυκεντρικών μελετών για την συγκέντρωση και διαχείριση όλων των πληροφοριών.