Προσδιορισμός μηχανισμού καταστολής φυτοπαθογόνων μυκήτων από το pseudomonas fluorescens Χ και ανάπτυξη μολυσμάτων βακτηρίων στο κάλυμμα σπόρων ζαχαροτεύτλου

Abstract

Pseudomonas fluorescens X has the ability to suppress seed and seedling damping-offin sugar beet and cucumber. Spontaneous mutagenesis and screening a library of 12000mutants, plasmid rescue, sequencing and complementation analysis showed that biocontrolability of X is related to genes involved in the biosynthesis of pyrroloquinoline quinone(PQQ), one gene encoding glucose dehydrogenase (gcd), and two more genes (sup5 andsup6), organized in a putative operon (supX ). The supX putative operon consists of fivegenes in total (one of which encodes a non-ribosomal peptide synthase (NRPS). A uniquebinding site for a transcriptional factor belonging to the GntR family of transcriptionalregulators is localized upstream of supX . Synteny analysis of of the supX putative operonand the GntR binding site revealed that it is found in several bacteria of the genusPseudomonas, but with a low degree of similarity to most. supX shows high similarity onlyto the mangotoxin biosynthesis operon in Ps. syringae pv. syringae UMAF0158. Quantitativereal-time PCR analysis indicated that transcription of supX is strongly reduced when gcd orone of the genes involved in the biosynthesis of PQQ is mutated. On the contrary,transcription of supX is induced by the presence of glucose in the medium and transcriptionlevels appear to be higher during the late exponential and stationary growth phase in the wildtype. Gcd, which uses the PQQ as a cofactor, catalyses the oxidation of glucose to gluconicacid, which has an inhibitory effect for some of the transcriptional factors of the GntR family,thus affecting the transcription of supX . This study provides evidence for a novel mechanismof biological control of P. ultimum by Ps. fluorescens X, controlled by the metabolism ofglucose. The biosynthesis of antifungal compound(s) by Ps. fluorescens X is controlled bygenes in the supX putative operon. This is the first report on the role of supX in biocontrol ofplant pathogens by a strain of Ps. fluorescens.

Το βακτήριο Pseudomonas fluorescens X είναι ικανός βιολογικός ανταγωνιστήςφυτοπαθογόνων μυκήτων και ωομυκήτων που προκαλούν τήξεις φυταρίων στοσακχαρότευτλο και το αγγούρι. Μετά από μεταλλαξιγένεση με το μεταθετό στοιχείο Tn5 καιεξέταση 12000 μεταλλαγμένων στελεχών, απομονώθηκαν εννέα μεταλλαγμένα στελέχη ταοποία είχαν χάσει την ικανότητα να παρεμποδίζουν την ανάπτυξη του ωομύκητα P. ultimumin vitro. O έλεγχος της καταπολέμησης του P. ultimum από τα γονίδια αυτά (φαινότυπος sup)απεδείχθη με επανόρθωση της μετάλλαξης από τα γονίδια αυτά in trans.Τα γονίδια με ένθεση του μεταθετού στοιχείου τα οποία είναι υπεύθυνα για τηνεμφάνιση του φαινοτύπου sup απομονώθηκαν με την τεχνική της πλασμιδιακήςαπελευθέρωσης. Τα γονίδια sup2, sup3 και sup4 κωδικοποιούν πρωτεΐνες (PqqE, PqqD,PqqF) οι οποίες εμπλέκονται στη βιοσύνθεση της πυρρολοκινολινκινόνης (PQQ) και φαίνεταιότι βρίσκονται οργανωμένα σε ένα οπερόνιο. Επιπλέον, βρέθηκε ακόμα ένα γονίδιο (sup1),το οποίο κωδικοποιεί την αφυδρογονάση της γλυκόζης και βρίσκεται σε διαφορετικήγονιδιωματική περιοχή από τα υπόλοιπα. Τέλος, δύο γονίδια (sup5 και sup6, τα οποίακωδικοποιούν αντίστοιχα μια πρωτεΐνη η οποία ανήκει στην οικογένεια των cupin πρωτεϊνώνκαι μια πρωτεΐνη άγνωστης λειτουργίας) φαίνεται ότι βρίσκονται οργανωμένα σε έναυποθετικό οπερόνιο (supX ).Ανωφερικά του υποθετικού οπερονίου supX , το οποίο περιέχει τρία ακόμα γονίδια(ένα από τα οποία κωδικοποιεί μια NRPS), εντοπίστηκε θέση αναγνώρισης ενόςμεταγραφικού παράγοντα της οικογένειας GntR. Μελέτη της συνταινίας του γονιδιακούτόπου του supX αποκάλυψε ότι είναι διαδεδομένο στο γένος Pseudomonas, αλλά με σχετικάχαμηλή ομοιότητα με τα ομόλογά του. Εμφανίζει μεγάλη ομοιότητα μόνο με το οπερόνιοβιοσύνθεσης της μανγκοτοξίνης από το στέλεχος Ps. syringae pv. syringae UMAF0158.Η έκφραση των γονιδίων του supX μελετήθηκε με ποσοτική Real-Time PCR.Διαπιστώθηκε ότι η έκφρασή τους επάγεται όταν το βακτήριο βρίσκεται στην ύστερηεκθετική φάση και στη φάση στασιμότητας της ανάπτυξής του παρουσία γλυκόζης στοθρεπτικό μέσο. Η έκφραση των γονιδίων του supX διακόπτεται στα μεταλλαγμένα στελέχητα οποία έχουν ένθεση του μεταθετού στοιχείου στα γονίδια βιοσύνθεσης του PQQ και στογονίδιο που κωδικοποιεί την αφυδρογονάση της γλυκόζης. Η αφυδρογονάση της γλυκόζηςκαι η PQQ φαίνεται ότι ρυθμίζουν έμμεσα την έκφραση των γονιδίων του οπερονίου supX ,οξειδώνοντας τη γλυκόζη σε γλυκονικό οξύ, το οποίο αποτελεί αναστολέα ορισμένων απότους μεταγραφικούς παράγοντες της οικογένειας GntR.Ο προτεινόμενος μηχανισμός δράσης του βακτηρίου υποδηλώνει την βιοσύνθεσηενός δευτερογενούς μεταβολίτη, πιθανώς κάποιου κυκλικού λιποπεπτιδίου, από το supX καιτην ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων αυτών από τα επίπεδα του γλυκονικού οξέος. Τόσοο μηχανισμός αυτός, όσο και τα γονίδια του υποθετικού οπερονίου supX αποτελούν πρώτηεπιστημονική καταγραφή μηχανισμού βιολογικής καταπολέμησης φυτοπαθογόνων μυκήτωναπό ανταγωνιστές του γένους Pseudomonas.