Μοριακή ανάλυση και ρόλος του γονιδίου pescadillo στην κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση

Abstract

Pescadillo is a highly conserved eukaryotic gene from yeasts to human, and it has been shown to impact on both the cell cycle and on ribosome biogenesis, the later through the processing of pre-rRNAs. Interestingly, in mammals, pescadillo expression has been found to be up regulated in various cancers. Respective studies for the plant orthologues were lacking, and the functional role of these genes for plant growth and/or differentiation remained unknown. With the present study, the plant orthologues of pescadillo gene from the angiosperms Arabidopsis thaliana and Zinnia elegans, designated respectively as AtPES and ZePES, were isolated and characterized. In silico analysis of the polypeptide chain of the respective proteins showed that they are highly homologous with orthologues from other organisms, yet they constitute a separate group in the phylogenetic dendrogram. The primary structure of AtPES and ZePES proteins mainly consists of 1) a N-terminus pescadillo domain and 2) a central BRCT domain. At least three nuclear localization signals (NLS) are also found in the primary structure of the plant orthologues. AtPES expression was monitored throughout plant growth and reproduction, using both a semi quantitative RT-PCR, and a histochemical GUS approach, in transgenic plants designed to express the beta glucuronidase gene (GUS) under the control of the AtPES promoter. Semi quantitative RT-PCR analysis revealed that AtPES is ubiquitously expressed in all plant tissues tested. Furthermore, elevated levels of gene expression were found in seedlings, root tips, apical portions of the shoot and in developing and mature flowers. GUS analysis on the other hand clearly demonstrated that AtPES is predominately expressed in meristematic and reproductive tissues such as the root apical meristem (RAM), the developing primordia of the lateral roots, the shoot apical meristem (SAM), the developing primordia of the aerial organs, the developing and mature pollen, the developing megagametophyte and the developing embryos. A weaker signal of GUS expression was observed in the stele of the root, in the trichome progenitor cells, in the nerves of the leaves, especially in cotyledons, and in the hydathode cells of the later. The subcellular localization of AtPES protein was studied in transgenic Arabidopdis plants harboring a construct of AtPES fused to a gene encoding for the yellow fluorescent protein YFP. It was shown that the chimerical 168 protein was targeted to the nucleolus, in specific sub domains that constitute the granular component of the organelle, where the endonucleolytic cuts in the internal transcribed spacers (ITS) of pre-rRNAs take place. Semi quantitative RT-PCR analysis was conducted for monitoring the expression of ZePES in the course of trans-differentiation of mesophyll cells to tracheary elements in the in vitro system of Z. elegans. A reduction of ZePES expression was observed 4 to 8 hours after the addition of the inductive medium. ZePES expression was further shown to be up regulated 12, 16 and 20 hours following the addiction of the inductive medium. Based on the expression of genes that mark specific points of the cell cycle it could be deducted that ZePES expression is strong at G1/S and G2/M checkpoints of the cell cycle. Functional complementation experiments in budding yeast, using the thermosensitive degron strain Y40047, have led to the discovery that AtPES and ZePES can substitute for the endogenous yeast pescadillo orthologue in respects of normal yeast growth, thus implying conserved functions of pescadillo proteins in yeasts and plants. Moreover, yeast two hybrid system and bimolecular fluorescence complementation experiments confirmed the physical interaction between AtPES and both AtPEIP1 and AtPEIP2 proteins, thus providing evidence for the existence of a heterotrimeric PeBoW complex in plants. Overexpression of AtPES in transgenic Arabidopsis plants wasn’t shown to impact on plant growth and development. In contrast, down-regulating the gene’s expression by means of a RNA interference technology controlled by the addition of 17- β-estradiol in the medium, led to a series of interesting phenotypes. A reduction up to 70% of the length of the primary root was observed. Microscopic examination of the same roots revealed a series of phenotypic anomalies. In the root differentiation zone, the cells of the epidermis and the cortex appear enlarged and distorted, whereas in the RAM, the pattern of the cell files appears to be distorted in the severe phenotypes. Furthermore, RT-PCR analysis revealed the accumulation of unprocessed 35S pre- RNAs in the respective abnormal roots. On the whole our data indicate that AtPES is essential for normal plant growth and development and that this gene is possibly linked to specific, yet not elucidated to date mechanisms, that mediate the coordination of the cell cycle and the cellular growth in the plant meristems. For deciphering of AtPES transcriptional control, the 5’ untranslated region of the gene was analyzed. A series of transgenic Arabidopsis lines were generated, 169 designed to express the GUS gene under the control of various, successive deletions of the AtPES promoter. GUS expression in these lines was studied both qualitatively and quantitatively. Analysis revealed important cis regulating elements such as the TELObox and the site II motifs, which contribute to the differential expression of AtPES in the various tissues and organs. Moreover, in site directed mutagenesis experiments confirmed that TELO-box is crucial for the differential expression of AtPES gene primarily in the RAM and secondly in the SAM.

Το pescadillo είναι ένα εξελικτικά συντηρημένο γονίδιο στις ζύμες και στους ζωικούς οργανισμούς, ενώ λειτουργικά έχει δειχθεί ότι εμπλέκεται στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και στη βιογένεση των ριβοσωμάτων δια μέσου της επεξεργασίας πρόδρομων rRNA. Ενδιαφέρον παρουσιάζει επίσης το γεγονός ότι η έκφρασή του είναι αυξημένη σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, μέχρι σήμερα δεν είχε χαρακτηριστεί κανένα ορθόλογο γονίδιο από τα φυτά και ο λειτουργικός τους ρόλος στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση των φυτικών ιστών παρέμενε άγνωστος. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν τα φυτικά ορθόλογα γονίδια του pescadillo από τα αγγειόσπερμα Arabidopsis thaliana και Zinnia elegans, στα οποία αποδόθηκαν οι ονομασίες AtPES και ZePES αντίστοιχα. Η in silico ανάλυση της αμινοξικής αλληλουχίας των πρωτεϊνών έδειξε ότι παρουσιάζουν σημαντικό βαθμό ομολογίας με αυτές άλλων οργανισμών, σχηματίζοντας ωστόσο το δικό τους κλάδο στο φυλογενετικό δενδρόγραμμα. Η πρωτοταγής τους δομή αποτελείται από 1) μια αμινοτελική pescadillo λειτουργική περιοχή και 2) από μια κεντρική BRCT λειτουργική περιοχή, ενώ παρουσιάζει τουλάχιστον τρία σήματα πυρηνικού εντοπισμού (NLS). Το αναπτυξιακό πρότυπο της έκφρασης του AtPES μελετήθηκε τόσο με ημιποσοτική RT-PCR όσο και με ιστοχημική ανάλυση GUS σε διαγονιδιακά φυτά Arabidopsis, που εξέφραζαν το γονίδιο της β-γλουκουρονιδάσης (GUS) υπό την καθοδήγηση του υποκινητή του AtPES. Τα αποτελέσματα της RT-PCR έδειξαν ότι το γονίδιο εκφράζεται σε όλους τους ιστούς των φυτών που μελετήθηκαν, ενώ παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση στα αρτίβλαστα, στα ακρόρριζα, σε ακραία τμήματα των βλαστών, όπως επίσης και σε αναπτυσσόμενα και ώριμα άνθη. Με την κατά GUS ιστοχημική ανάλυση βρέθηκε ότι το γονίδιο εκφράζεται πρωτίστως στους μεριστωματικούς ιστούς, όπως στο ακραίο μερίστωμα της ρίζας (ΑΜΡ), στις καταβολές πλάγιων ριζών, στο ακραίο μερίστωμα του βλαστού (ΑΜΒ) και στις καταβολές των οργάνων. Επίσης, παρατηρήθηκε έντονη παρουσία σήματος GUS στα πρόδρομα κύτταρα των γυρεόκοκκων, με το σήμα να διατηρείται και στους ώριμους γυρεόκοκκους. Παράλληλα παρατηρήθηκε έκφραση GUS στις ωοθήκες και στα αναπτυσσόμενα έμβρυα. Το γονίδιο εκφράζεται ασθενέστερα στον κεντρικό κύλινδρο 164 της ρίζας, στα πρόδρομα κύτταρα των τριχών των φύλλων, στις νευρώσεις των φύλλων και κυρίως των κοτυληδόνων καθώς και στα κύτταρα των υδατωδίων των τελευταίων. Η ενδοκυτταρική τοπολογία της πρωτεΐνης AtPES μελετήθηκε σε κατάλληλα μετασχηματισμένα φυτά που εξέφραζαν μια κατασκευή μεταφραστικής σύντηξης του AtPES με το γονίδιο της φθορίζουσας πρωτεΐνης YFP. είχτηκε ότι η AtPES-YFP πρωτεϊνική χίμαιρα εντοπίζεται στον πυρηνίσκο των κυττάρων, και εντονότερα, σε διακριτές περιοχές που συνιστούν το κοκκώδες τμήμα του οργανιδίου, στο οποίο πραγματοποιείται η ενδονουκλεολυτική πέψη στα ITS (internal transcribe spacers) των πρόδρομων rRNA. Η έκφραση του ZePES μελετήθηκε με ημιποσοτική RT-PCR κατά τη διάρκεια της αποδιαφοροποίησης και ακόλουθης επαναδιαφοροποίησης κυττάρων του μεσοφύλλου σε τραχειακά στοιχεία, στο in vitro κυτταρικό σύστημα του Z. elegans. Παρατηρήθηκε μείωση της έκφραση του ZePES 4 και 8 ώρες μετά την προσθήκη του επαγωγικού μέσου καλλιέργειας, και ακόλουθη αύξηση στους χρόνους 12, 16 και 20 ώρες μετά την προσθήκη του επαγωγικού μέσου. Σύμφωνα με τα πρότυπα γονιδίων μαρτύρων του κυτταρικού κύκλου, τα μετάγραφα του ZePES είναι άφθονα στις φάσεις ελέγχου του κυτταρικού κύκλου G1/S και G2/M. Πειράματα συμπληρωματικότητας των AtPES και ZePES χρησιμοποιώντας το θερμοευαίσθητο μεταλλαγμένο στέλεχος degron Υ40047 του ζυμομύκητα οδήγησαν σε διάσωση του θνησιγενούς φαινοτύπου της ζύμης, υποδεικνύοντας τη λειτουργική συντήρηση μεταξύ φυτών και ζύμης. Επίσης, με τη χρησιμοποίηση τόσο του συστήματος των δύο υβριδίων του ζυμομύκητα όσο και του συστήματος του φθορισμού διμοριακής συμπληρωματικότητας, επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη των ετεροδιμερών πρωτεϊνικών συμπλόκων AtPES-AtBOP1 και AtPES-AtWDR12, υποστηρίζοντας την ύπαρξη ενός συντηρημένου ετεροτριμερούς συμπλόκου PeBoW. Η υπερέκφραση του AtPES σε κατάλληλα μετασχηματισμένα φυτά δεν οδήγησε στον εντοπισμό φαινοτυπικών ανωμαλιών σε σύγκριση με τα φυτά του αγρίου τύπου στις συνθήκες που μελετήθηκαν. Αντίθετα, η καταστολή της έκφρασης του γονιδίου με τη χρήση κατασκευών ελεγχόμενης (με 17-β-οιστραδιόλη) γονιδιακής σίγησης (RNAi), οδήγησε σε μια σειρά από ενδιαφέροντες φαινοτύπους. Παρατηρήθηκε μείωση της ανάπτυξης των φυτών και ιδιαίτερα μείωση του μήκους της κύριας ρίζας σε ποσοστό που έφτανε το 70%. Η μικροσκοπική παρατήρηση παρασκευασμάτων ριζών από φυτά με δριμύ φαινότυπο αποκάλυψε την ύπαρξη διογκώσεων και παραμορφώσεων στα επιδερμικά κύτταρα και τα κύτταρα του φλοιού στη ζώνη διαφοροποίησης, όπως επίσης 165 και μια έντονη διατάραξη του πρότυπου του ΑΜΡ. Στα ίδια φυτά, παρουσία 17-β- οιστραδιόλης, διαπιστώθηκε αύξηση των μετάγραφων του 35S πρόδρομου rRNA. Στο σύνολό τους, τα παραπάνω αποτελέσματα συνηγορούν υπέρ ενός σημαντικού αναπτυξιακού ρόλου για το AtPES γονίδιο, και την πιθανή εμπλοκή του σε βασικούς μηχανισμούς συντονισμού του κυτταρικού κύκλου και της αύξησης των κυττάρων στους μεριστωματικούς ιστούς. Προκειμένου να μελετηθεί περαιτέρω ο τρόπος ρύθμισης του γονιδίου AtPES, αναλύθηκε επίσης η 5’ ρυθμιστική περιοχή του. ημιουργήθηκαν διαγονιδιακές σειρές φυτών με διαδοχικές απαλοιφές του υποκινητή του AtPES και μεταγραφική σύντηξη των τμημάτων του με το γονίδιο αναφοράς GUS. Η έκφραση του GUS στις σειρές αυτές των φυτών μελετήθηκε ποιοτικά και ποσοτικά. Οι αναλύσεις αποκάλυψαν την ύπαρξη σημαντικών cis ρυθμιστικών στοιχείων όπως π.χ. των TELO-box και των μοτίβων site II, τα οποία συμμετέχουν στη διαφορική έκφραση του γονιδίου στους διάφορους φυτικούς ιστούς και στα διάφορα όργανα. Επιπρόσθετα, πειράματα στοχευμένης μεταλλαξιγένεσης απέδειξαν ότι το TELO-box εμπλέκεται καθοριστικά στη διαφορική έκφραση του AtPES πρωτίστως ΑΜΡ και δευτερευόντως στο ΑΜΒ.