Μοριακή ποικιλότητα και αφθονία προκαρυωτικών οργανισμών του πεπτικού συστήματος της καραβίδας ( nephrops norvegicus) σε φυσικούς και εκτρεφόμενο...

Abstract

2. The Norway lobster Nephrops norvegicus, also known as Dublin bay prawn is a Decapod Crustacean of the Family Nephropidae that is widely distributed in silty areas, of the continental shelf and the upper continental slope, of the Northeast Atlantic and the Mediterranean Sea. The Norway lobster is a highly commercial species in the areas where it is found. Efforts for the commercial rearing of the species have not succeeded yet due to lack of knowledge on the nutritional habits of the species on rearing conditions and on its exact nutritional demands. 3. This thesis studied for the first time the gut bacterial diversity of Nephrops norvegicus. Studies were performed in natural and reared populations, where different food sources were provided. The project targeted in finding the factors that shape gut bacterial diversity and in detecting symbiotic, non toxic and non pathogenic bacterial species that can influence the digestive functions of N. norvegicus and could potentially be used as probiotics in future rearing efforts. 4. For the study of the natural populations N. norvegicus individuals were collected from Pagasitikos gulf during different months in 2007. The digestive tract was extracted and evacuated, followed by DNA extraction. DNA was analyzed with the use of molecular tools studying 16S rRNA and the Intergenic Transcribed Spacer (ITS). The 16S rRNA diversity was studied with the use of clone libraries and Fluorescence in Situ Hybridization (FISH) while the ITS diversity was studied with the use of clone libraries and Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (ARISA). The study of the ITS diversity with the use of ARISA showed that gut bacterial microdiversity was influenced by sampling season while other factors that were checked such as sex or weight had no influence. Seasonal differences in Pagasitikos gulf, and mostly in the areas where N. norvegicus is found, are based in changes in food availability and quality and not in physicochemical factors. In this area temperature and salinity are almost stable all over the year, while changes are observed in the quantity and the quality of the organic matter from upper layers that finally influences the trophic webs in the bottom. 5. Further analysis of selected samples from all collection months with 16S-ITS clone libraries showed the dominance of specific phylotypes (>58%) in each one of them. The dominant phylotypes in the samples of February/March, May, July, August and October clustered in the genera of Pseudoalteromonas, Psychrobacter and Photobacterium while the ones in the samples of September and December clustered in an uncultured Mollicutes group and in the candidate division CK-1C4-19 respectively. The presence of γ-Proteobacteria in August samples and of uncultured Mollicutes in September samples was further verified with the FISH results. For the detection of cells belonging to γ-Proteobacteria, probe GAM42a was used while for the cells belonging to the dominant Mollicute phylotype a specific probe was designed. 6. The combination of ARISA results with the ITS lengths of the dominant phylotypes from the clone libraries further confirmed the presence of Photobacterium sp. and Psychrobacter sp. representatives in most of the samples studied. However the presence of the Mollicutes and CK-1C4-19 phylotypes was underestimated in the ARISA as a result of mismatches of their sequences with the primers used. 7. Rearing experiments were performed in order to confirm the effect of feeding in gut bacterial diversity. N. norvegicus individuals were divided in three groups and were kept for six months in rearing tanks where three different kinds of food were checked (S: starvation, M: mussels, P: pellets). Mussels and pellets were provided in the respective groups three times per week. In order to study the gut bacterial diversity, N. norvegicus samplings were performed at the beginning of the experiment (t0) and after three (t1) and six months (t2). At the same time water samples from the rearing tanks and samples from the food provided were analyzed. 8. All the samples were analyzed using 16S rRNA clone libraries. Samples from the initial time point (t0) had similar results with the natural populations showing low bacterial diversities and dominant phylotypes with closest relatives belonging to the genera Psychrobacter and Photobacterium. All samples after six month rearing with pellets and mussels showed higher bacterial diversity than wild samples. However all of them had dominant phylotypes, with frequencies ranging from 22% to 73.5%, clustering in the species Photobacterium leiognathi and showing high percentages of similarity (>98%) with the respective Photobacterium like phylotypes of the wild populations. Previous microbiological and genomic studies have shown the presence of lipolytic, proteinolytic and chitinolytic enzymes in P. leiognathi enhancing the hypothesis of its assistance in N. norvegicus digestive activity. 9. Starvation samples as well as the three months mussel reared sample showed higher bacterial diversity than all other samples. As it was proved after statistical analysis their bacterial diversity was mostly influenced by the tanks’ water bacterial diversity. Statistical analysis for all samples showed the existence of two groups depending mostly on whether food was provided or not regardless of its kind. The basic discriminative characteristic between these two groups was the presence of phylotypes clustering in P. leiognathi. 10. For the first time, it was proved that food provision is an important factor for the shaping of gut bacterial communities of N. norvegicus. The factors that shape gut bacterial diversity, as well as abundant and potentially symbiotic microorganisms were detected. Bacterial phylotypes clustering in P. leiognathi with potential chitinolytic, proteinolytic and lipolytic activities were found abundant in the gut of wild and reared populations of N. norvegicus suggesting their use as probiotics in future rearing efforts.

Η καραβίδα Nephrops norvegicus ή Νορβηγικός αστακός αποτελεί ένα μέλος της οικογένειας Nephropidae των καρκινοειδών και είναι ένα είδος ευρέως κατανεμημένο σε ιλυώδεις περιοχές της ηπειρωτικής κρηπίδας και της ανώτερης ηπειρωτικής κατωφέρειας του Βορειοανατολικού Ατλαντικού και της Μεσογείου. Το N. norvegicus αποτελεί ένα ιδιαίτερα εμπορικό είδος στις περιοχές όπου εντοπίζεται. Για αυτό το λόγο πραγματοποιούνται προσπάθειες για την εμπορική καλλιέργειά του οι οποίες δεν έχουν επιτευχθεί ακόμα εξαιτίας της ελλιπούς γνώσης σχετικά με τις διατροφικές συνήθειές του σε συνθήκες εργαστηρίου αλλά και σχετικά με τις ακριβείς διατροφικές του απαιτήσεις. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε για πρώτη φορά η βακτηριακή ποικιλότητα και αφθονία του πεπτικού συστήματος του N. norvegicus σε φυσικούς και εκτρεφόμενους πληθυσμούς υπό την παροχή διαφορετικών σιτηρεσίων. Σκοπός ήταν η μελέτη της βακτηριακής ποικιλότητας του μεσέντερου, η εύρεση των παραγόντων που την επηρεάζουν, η ανίχνευση των επικρατών φυλότυπων σε φυσικούς και εκτρεφόμενους πληθυσμούς, καθώς και ο εντοπισμός συμβιωτικών, μη τοξικών και μη παθογόνων βακτηριακών ειδών με πιθανή προσφορά στις πεπτικές λειτουργίες, που θα μπορούσαν στο μέλλον να χρησιμοποιηθούν ως προβιοτικά σε προσπάθειες εμπορικής εκτροφής. Για τη μελέτη των φυσικών πληθυσμών συλλέχθηκαν 49 άτομα από τον Παγασητικό Κόλπο σε σχεδόν μηνιαία βάση κατά τη διάρκεια του 2007. Απομονώθηκε DNA από τον πεπτικό σωλήνα των δειγμάτων, το οποίο αναλύθηκε με τη χρήση μοριακών τεχνικών μελέτης του 16S rRNA και του διαγονιδιακού ριβοσωμικού χώρου (Intergenic Transcribed Spacer, ITS). Η μελέτη του ITS με την τεχνική της αυτοματοποιημένης ανάλυσης του διαγονιδιακού ριβοσωμικού χώρου (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis, ARISA) έδειξε ότι η εποχή συλλογής των δειγμάτων επηρέαζε τη βακτηριακή ποικιλότητα του πεπτικού σωλήνα σε αντίθεση με άλλους παράγοντες, όπως το φύλο ή το βάρος που δεν είχαν καμία επίδραση. Στον Παγασητικό κόλπο και στα σημεία που ζει το N. norvegicus οι εποχικές αλλαγές εντοπίζονται κυρίως σε αλλαγές στη διαθεσιμότητα της τροφής και όχι στις φυσικοχημικές συνθήκες, δείχνοντας ότι οι εποχικές αλλαγές της βακτηριακής ποικιλότητας του μεσέντερου πιθανότατα οφείλονταν σε αλλαγές στην κατανάλωση τροφής. Η περαιτέρω ανάλυση επιλεγμένων δειγμάτων από κάθε μήνα συλλογής με 16S-ITS βιβλιοθήκες έδειξε την ύπαρξη επικρατών φυλότυπων (>58%) σε κάθε μία από αυτές. Στα δείγματα του Φεβρουαρίου/Μαρτίου, Μαΐου, Ιουλίου, Αυγούστου και Οκτωβρίου εντοπίστηκαν φυλότυποι με κοντινότερους συγγενείς από τα γένη Pseudoalteromonas, Psychrobacter και Photobacterium ενώ στα δείγματα του Σεπτεμβρίου και του Δεκεμβρίου εντοπίστηκαν φυλότυποι από μία ακαλλιέργητη ομάδα των Mollicutes και από το ακαλλιέργητο υποψήφιο φύλο CK-1C4-19, αντίστοιχα. Η παρουσία των ακαλλιέργητων Mollicutes στα δείγματα του Σεπτεμβρίου και των γ-Proteobacteria στα δείγματα του Αυγούστου επιβεβαιώθηκε και με την τεχνική του επιτόπιου φθορίζοντος υβριδισμού (Fluorescence in Situ Hybridization, FISH). Ο συνδυασμός των αποτελεσμάτων της ARISA με τις αλληλουχίες των ITS από τις βιβλιοθήκες έδειξε για άλλη μία φορά την έντονη παρουσία αντιπροσώπων των γενών Photobacterium και Psychrobacter στα περισσότερα από τα δείγματα που μελετήθηκαν. Για την εξακρίβωση της επίδρασης της τροφής στη βακτηριακή ποικιλότητα του εντέρου πραγματοποιήθηκαν πειράματα εκτροφής στο εργαστήριο. Συνολικά οχτώ άτομα N. norvegicus χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες και παρέμειναν για έξι μήνες σε ειδικές ατομικές δεξαμενές, όπου ελέγχθηκαν τρία είδη διατροφής (S: ασιτία, M: μύδια και Ρ: σύμπηκτα), με ελεγχόμενη παροχή τροφής τρεις φορές την εβδομάδα. Για τη μελέτη της βακτηριακής ποικιλότητας του μεσέντερου πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες στην αρχή του πειράματος (t0), στους τρεις μήνες (t1) και στους έξι μήνες (t2). Παράλληλα αναλύθηκαν και δείγματα νερού από τα ενυδρεία, αλλά και από τις τροφές που παρασχέθηκαν. Τα δείγματα αυτά αναλύθηκαν με 16S rRNA βιβλιοθήκες. Τα αρχικά δείγματα (t0) παρουσίασαν αντίστοιχα αποτελέσματα με τους φυσικούς πληθυσμούς, με χαμηλή βακτηριακή ποικιλότητα και με επικρατείς φυλότυπους με πλησιέστερους συγγενείς από τα γένη Psychrobacter και Photobacterium. Τα δείγματα από τις εκτροφές με σύμπηκτα και μύδια, για χρονική περίοδο έξι μηνών, παρουσίασαν υψηλότερη ποικιλότητα από τα δείγματα των φυσικών πληθυσμών αλλά σε όλα εντοπίστηκαν σε υψηλές αφθονίες (22%-73,5%) αντιπρόσωποι του είδους Photobacterium leiognathi παρόμοιοι (> 98%) με τους φυλότυπους των φυσικών πληθυσμών. Μικροβιολογικές και γονιδιωματικές μελέτες από προηγούμενες έρευνες έχουν ανιχνεύσει τις λιπολυτικές, χιτινολυτικές και πρωτεϊνολυτικές ιδιότητες του P. leiognathi, δείχνοντας τις πιθανές ευεργετικές δράσεις αυτού του είδους στην πεπτική λειτουργία του N. norvegicus. Τα δείγματα της ασιτίας, καθώς και αυτό από την τρίμηνη εκτροφή με μύδια, παρουσίασαν υψηλότερη ποικιλότητα από όλα τα υπόλοιπα και η ποικιλότητά τους, όπως αποδείχθηκε από τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων, φάνηκε να επηρεάζεται κυρίως από τη βακτηριακή ποικιλότητα του νερού των δεξαμενών. Η βακτηριακή ποικιλότητα των τροφών δε φάνηκε να επηρεάζει τη βακτηριακή ποικιλότητα του μεσέντερου. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων για όλα τα δείγματα έδειξε την ύπαρξη δύο ομάδων, εξαρτώμενων κυριώς από το αν είχε καταναλωθεί τροφή ανεξαρτήτως του είδους της. Βασικό διακριτικό χαρακτηριστικό των δύο ομάδων αποδείχθηκε η παρουσία αντιπροσώπων του είδους P. leiognathi. Συνεπώς φάνηκε ότι η παροχή τροφής αποτελεί έναν καθοριστικό παράγοντα για τη διαμόρφωση της βακτηριακής ποικιλότητας του πεπτικού συστήματος του N. norvegicus. Για πρώτη φόρα βρέθηκε ότι συγκεκριμένα βακτηριακά είδη όπως το P. leiognathi, με πιθανές λιπολυτικές, πρωτεϊνολυτικές και χιτινολυτικές ιδιότητες, έχουν έντονη παρουσία στο πεπτικό σύστημα της καραβίδας και θα μπορούσαν στο μέλλον να χρησιμοποιηθούν ως προβιοτικά σε προσπάθειες εκτροφής του N. norvegicus. Συνολικά αυτή η μελέτη έδωσε σημαντικά στοιχεία για τη βακτηριακή ποικιλότητα του εντέρου του N. norvegicus και για τους παράγοντες που την καθορίζουν και έθεσε τις βάσεις για τις μελλοντικές προσπάθειες στη χρήση προβιοτικών για την εκτροφή του είδους.