Ανάπτυξη και αξιολόγηση συστημάτων χορήγησης πεπτιδικών αντιγόνων HER-2/neu συνδεδεμένων με PLA μικροσφαίρες

Abstract

Despite the progress of classic therapeutic strategies developed concerning cancer the greatest number of patients deteriorates and eventually dies. The need to confront this disease in an alternative way has led to the development of new immunotherapeutic methods. The identification of tumor-specific antigens that are identified by Τ cells gave a great boost to the development of Τ-cell-mediated specific immune response both in research for tumor immunology as in its clinical appliance. That led to the beginning of peptide use in vaccines in cancer immunotherapy. Among all known cancer antigens the HER-2/neu protein demonstrates the advantage of being overexpressed in various types of cancer while patients whose tumors overexpress the protein exhibit preexisting immunity against its peptides HER-2/neu is a transmembrane protein that is overexpressed in cancer cells and therefore the perfect target for immunotherapy concerning both cellular and humoral immunity. In the current study the type of the immune response after in vivo administration of HER-2/neu peptide loaded on poly-lactic acid (PLA) and PLGA microspheres [either absorbed or adsorbed (just mixed)] is investigated. The model antigens used were the following two: a) GSPYVSRLLGICLTSTVQLVQL peptide corresponds to the 779-799 amino acid sequence of the HER-2/neu protein. This amino acid sequence contains the cytotoxic epitope CLTSTVQLV (789-797) in combination with the Th epitope GSPYVSRLLGICL (778-790) of the HER-2/neu protein b) CLTSTVQLV (789-797) peptide which corresponds to merely the cytotoxic epitope HHD transgenic mice expressing human HLA-A2.1 histocompatibility molecules were used as subjects given the fact that the amino acid sequence chosen has derived from the human HER-2/neu protein. Converting the preexisting Th2 type of immune response against soluble antigens expressed in tumors to the Th1 type is extremely important in curing cancer. The type of the immune response has been determined at cellular level using proliferation assay and cytokine measurement assay usually at cell culture supernatants but also in blood samples. The in vivo administration of the peptide antigen just admixed with PLA microspheres induced potent immune response comparable to that caused by the antigen administration using complete Freund’s adjuvant (CFA). Moreover, upon the analysis of the cytokine profile secreted from Τ lymphocytes of immunized mice, the PLA admixed peptide proved to induce a specific and potent Th1 immune response. The incubation time of the peptide with PLA microspheres had no implications to the immune response, therefore further simplifying future mass production of such vaccine types. The results extracted by this study justify further investigation of the in vivo experimental cancer models for inducing potent cellular immune response against cancer cells that overexpress the HER-2/neu protein by simply mixing the appropriate HER-2/neu peptide antigens with PLA microspheres.

Παρά τις προόδους των κλασικών θεραπευτικών στρατηγικών για τον καρκίνο η μεγάλη πλειοψηφία των ασθενών υποτροπιάζει και καταλήγει. Η ανάγκη για την αντιμετώπιση της νόσου με εναλλακτικό τρόπο οδήγησε στην ανάπτυξη ανοσοθεραπευτικών μεθόδων. Η ταυτοποίηση ογκοειδικών αντιγόνων, έδωσε ιδιαίτερη ώθηση στην ανάπτυξη της κατευθυνόμενης από τα Τ κύτταρα ανοσολογικής απάντησης, και έθεσε τις βάσεις για τη χρησιμοποίηση πεπτιδικών εμβολίων στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Από τα γνωστά καρκινικά αντίγονα η διαμεμβρανική ογκοπρωτεΐνη HER-2/neu παρουσιάζει το πλεονέκτημα της υπερέκφρασης σε ποικίλους τύπους καρκίνου, και επομένως καθίσταται στόχος για ανοσοθεραπευτικές προσεγγίσεις. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε ο τύπος της ανοσοαπόκρισης που λαμβάνεται in vivo μετά την χορήγηση πεπτιδίων της HER-2/neu συνδεμένων (προσροφημένο ή απλά αναμεμιγμένο) σε πολύ-γαλακτικού οξέος (PLA) και PLGA μικροσφαίρες. Τα αντιγόνα ήταν δύο: α) το πεπτίδιο GSPYVSRLLGICLTSTVQLVQL που αντιστοιχεί στην περιοχή 778-799 της HER-2/neu. Η πεπτιδική αυτή ακολουθία περιλαμβάνει τον κυτταροτοξικό (CTL) επίτοπο CLTSTVQLV (789-797) σε συνδυασμό με τον Τ βοηθητικό (Th) επίτοπο GSPYVSRLLGICL (778-790) και β) το πεπτίδιο CLTSTVQLV (789-797) δηλαδή μόνο ο CTL επίτοπος. Ως πειραματόζωα στην συγκεκριμένη περίπτωση χρησιμοποιήθηκαν HHD διαγονιδιακοί μύες, οι οποίοι εκφράζουν ανθρωπινά HLA-Α2.1 μόρια ιστοσυμβατότητας δεδομένου ότι η ακολουθία του πεπτιδίου που έχει επιλεγεί προέρχεται από την ανθρώπινη HER-2/neu. Η μετατροπή της ανοσοαπόκρισης Th2 τύπου, εναντίον διαλυτών αντιγόνων που εκφράζονται σε καρκινικούς όγκους σε Th1 τύπο ανοσοαπόκρισης είναι σημαντική στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Η ταυτοποίηση του τύπου της ανοσοαπόκρισης έγινε με τον προσδιορισμό του τύπου της ανοσοαπόκρισης σε κυτταρικό επίπεδο με την ανάπτυξη τεχνικών μέτρησης της ικανότητας του πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων και με μέτρηση των κυτοκινών σε υπερκείμενα καλλιεργειών λεμφοκυττάρων. Η in vivo χορήγηση του πεπτιδικού αντιγόνου που απλά και μονό αναμίχθηκε με PLA μικροσφαίρες προκάλεσε μια ισχυρή ανοσολογική απόκριση που ήταν συγκρίσιμη με αυτήν που προκλήθηκε από το συνδυασμό του αντιγόνου με πλήρες ανοσοενισχυτικό του Freund (CFA). Επιπλέον, μετά από ανάλυση του προφίλ των κυτοκινών που εκκρίνονται από τα Τ λεμφοκύτταρα των ανοσοποιημένων μυών αποδείχθηκε ότι ο συνδυασμός του αντιγόνου πεπτιδίων με τις PLA μικροσφαίρες προκάλεσε μια ισχυρή ΤΜ ανοσολογική απόκριση στο αντιγόνο. Ο χρόνος της επώασης πεπτιδίων με τις μικροσφαίρες πριν από τη χορήγηση δεν είχε επιπτώσεις στην ανοσολογική απόκριση γεγονός που απλοποιεί περαιτέρω την παράγωγη σε ευρεία κλίμακα αυτού του τύπου εμβολίων. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν δικαιολογούν την περαιτέρω διερεύνηση σε in vivo πειραματικά μοντέλα καρκίνου της δυνατότητας επαγωγής ισχυρής κυτταρικής ανοσοαπόκρισης έναντι των καρκινικών κυττάρων που υπερεκφράζουν την HER-2/neu πρωτεΐνη με απλή ανάμιξη κατάλληλων πεπτιδικών αντιγόνων της HER-2/neu με PLA μικροσφαίρες.