Ανάπτυξη και βελτιστοποίηση μεθόδων προσδιορισμού απεξαρτησιογόνων ουσιών σε βιολογικά δείγματα και εφαρμογή τους στην παρακολούθηση τ...

Abstract

Methadone (MDN) is used extensively for the maintenance of opioid addicts and it is the only treatment approved for opiate substitution during pregnancy and postpartum period, in Greece and in other countries. There are inter-individual differences in bioavailability and pharmacokinetic of MDN. Therapeutic monitoring of MDN and its metabolites (EDDP and EMDP) plasma levels is often necessary, in order to determine MDN dose and to obtain maximum treatment efficacy. Furthermore, MDN, EDDP and EMDP are excreted into breast milk, but there is no correlation between the MDN dose and breast milk MDN and its metabolites levels. Subsequently, the determination of MDN and its metabolites concentrations in breast milk is needed for the investigation of breastfeeding safety of newborns whose mothers are MDN maintained. The purpose of this study was to develop, optimize and validate gas chromatography-mass spectrometric methods for the determination of MDN, EDDP and EMDP in plasma and breast milk. Sample preparation included protein precipitation with acetonitrile and solid-phase extraction of the three analytes. MDN-d9 was used as internal standard for the determination of MDN and EMDP, while EDDP-d3 for EDDP. The following parameters were used to validate the GC/MS methods: selectivity, specificity, linearity, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), intra- / inter-day precision and accuracy, absolute recovery and robustness, as well as the stability of standards and spiked biological samples. The methods developed could be used for: a) therapeutic drug level monitoring in patients that follow MDN maintenance programs, b) determination of MDN and its metabolites in plasma samples obtained from arterial and venous umbilical cord blood in order to investigate MDN exposure of the fetus and c) determination of MDN and its metabolites concentrations in breast milk of MDN maintained mothers. Furthermore, the methods developed could find significant applications in Clinical and Forensic Toxicology, and provide useful data for critical decision making concerning acceptance of breastfeeding from MDN maintained mothers.

Η μεθαδόνη (MDN) χρησιμοποιείται ευρέως στην θεραπεία υποκατάστασης εξαρτημένων από οπιοειδή ατόμων και αποτελεί την μόνη θεραπεία υποκατάστασης που επιτρέπεται κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης και της επιλόχειας περιόδου, στην Ελλάδα και σε άλλες χώρες. Η φαρμακοκινητική και η βιοδιαθεσιμότητα της MDN ποικίλλουν από άτομο σε άτομο. Η παρακολούθηση των επιπέδων της MDN και των μεταβολιτών της (EDDP και EMDP) στο πλάσμα ασθενών που συμμετέχουν σε πρόγραμμα υποκατάστασης, είναι πολλές φορές αναγκαία προκειμένου να ρυθμιστεί το δοσολογικό σχήμα του ασθενή και η θεραπεία υποκατάστασης να είναι αποτελεσματική. Επίσης, η MDN, η EDDP και η EMDP απεκκρίνονται στο μητρικό γάλα, ενώ δεν υπάρχει καθορισμένη σχέση μεταξύ του δοσολογικού σχήματος MDN και των επιπέδων αυτής και των μεταβολιτών της στο μητρικό γάλα. Επομένως, ο προσδιορισμός των συγκεντρώσεων της MDN και των μεταβολιτών της στο μητρικό γάλα θεωρείται απαραίτητος για τη διερεύνηση της ασφάλειας του θηλασμού νεογνών που οι μητέρες τους συμμετέχουν σε πρόγραμμα υποκατάστασης με MDN. Σκοπός αυτής της Διδακτορικής Διατριβής ήταν η ανάπτυξη, βελτιστοποίηση και αξιολόγηση μεθόδων αεριοχρωματογραφίας σε συνδυασμό με φασματομετρία μαζών για τον προσδιορισμό της MDN, της EDDP και της EMDP, σε πλάσμα και μητρικό γάλα. Η κατεργασία των βιολογικών δειγμάτων περιελάμβανε καταβύθιση πρωτεϊνών με ακετονιτρίλιο και εκχύλιση στερεής φάσης. Στις μεθόδους χρησιμοποιήθηκε η MDN-d9 ως εσωτερικό πρότυπο για τον προσδιορισμό της MDN και της EMDP, ενώ η EDDP-d3 της EDDP. Οι παράμετροι αξιολόγησης των μεθόδων ήταν: εκλεκτικότητα, ειδικότητα, γραμμικότητα, κατώτατο όριο ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης, επαναληψιμότητα, ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα, ορθότητα εντός της ημέρας και δια των ημερών, απόλυτη ανάκτηση και ανθεκτικότητα των μεθόδων, καθώς και σταθερότητα των αναλυτών σε πρότυπα διαλύματα και εμβολιασμένα βιολογικά δείγματα. Οι αναπτυχθείσες μέθοδοι μπορούν να βρουν εφαρμογή: α) στην παρακολούθηση των επιπέδων του φαρμάκου σε ασθενείς που συμμετέχουν σε πρόγραμμα υποκατάστασης με MDN, β) στον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων MDN και μεταβολιτών της σε δείγματα πλάσματος που ελήφθησαν από το αρτηριακό και φλεβικό αίμα του ομφάλιου λώρου, προκειμένου να διερευνηθεί η έκθεση του εμβρύου σε MDN και γ) στον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων της MDN και των μεταβολιτών της στο μητρικό γάλα γυναικών που συμμετέχουν σε πρόγραμμα υποκατάστασης. Παράλληλα, οι αναπτυχθείσες μέθοδοι μπορούν να βρουν εφαρμογή στην αντιμετώπιση διαγνωστικών προβλημάτων στο πλαίσιο της Κλινικής και Δικαστικής Τοξικολογίας, και να παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες για την αποδοχή ή μη του θηλασμού νεογνών που οι μητέρες τους συμμετέχουν σε πρόγραμμα υποκατάστασης με MDN.