Ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων που ελέγχουν τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA στα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα

Abstract

Myelodysplastic syndromes (MDS) are characterized by genetic instability which is associated with abnormal DNA repair mechanisms. The most lethal type of DNA damage are double strand DNA breaks (DSBs), which are mainly repaired by Non Homologous End Joining Mechanism (NHEJ), whose core enzyme components include the Ku70/Ku80 heterodimer, DNA-PKcs, XRCC4 and DNA Ligase IV. The aim of the present study was the analysis of expression of proteins required for NHEJ in bone marrow cells of adult de novo MDS and their association with clinical characteristics and prognosis, as well as the determination of the integrity of the mechanism. Our analysis included 48 cases of MDS. The expression of the enzymes Ku70, Ku80, XRCC4, DNA-PKcs and Ligase IV was determined by Western Blotting. Our results were confirmed by Immunochemistry. The analysis of the integrity of the mechanism in CD34+ cells of MDS patients was performed by introduction into appropriate plamids, amplification of the product with PCR and digestion with appropriate enzymes. The final product was compared to the one that is expected in normal function of the mechanism. The median Ligase IV expression value was significantly lower in MDS patients compared to normal controls (0.51 vs. 0.74, p=0.03). A positive correlation was observed between enzyme Ku70 expression values and level of blasts (p=0.04). On the contrary, a negative correlation was found between Ku80 and the level of blasts. Furthermore, a negative correlation between Ku70 expression values and Hb levels was observed (p=0.04). Interestingly, a negative correlation was found between karyotype risk group and Ligase IV values. (p=0.05). On the contrary, Ku70 expression levels were significantly lower in patients with a good prognosis karyotype (p=0.04). The same phenomenon was observed between Ku70 expression levels and IPSS (p=0.07). Regarding the analysis of the integrity of the mechanism, there was no statistically significant difference between patients and controls. To our knowledge, this is the first study that examines the role of NHEJ mechanism in pathogenesis of MDS at a protein level, as well as the first one that analyzes the integrity of the mechanism in MDS. Our findings support a potential role of NHEJ enzyme Ligase IV in the pathogenesis of MDS. We also correlated Ku70 expression with a more aggressive disease. No significant differences were found with regards to NHEJ function between MDS and controls. Larger numbers of cases need to be screened in order to draw definite conclusions.

Τα Μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ) αποτελούν ετερογενή ομάδα διαταραχών του αρχέγονου πολυδύναμου αιμοποιητικού κυττάρου χαρακτηριζόμενα από γενετική αστάθεια, .που κατά ένα μέρος σχετίζεται σε μοριακό επίπεδο με διαταραχές στους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA. Η επιδιόρθωση των θραυσμάτων διπλής έλικας (DSB) γίνεται με δύο μηχανισμούς: Ηοmologous Recombination (HR) και Νon Homologous End Joining (NHEJ) με κυρίαρχο ρόλο στα ανώτερα θηλαστικά. O NHEJ μηχανισμός εξαρτάται από παράγοντες όπως τις δύο υποομάδες της πρωτεΐνης Ku (Ku70/Ku80), την πρωτεϊνική κινάση DNA-PKcs, και την πρωτεΐνη XRCC4 που ενεργοποιεί τη DNA ligase IV για την επανασύνδεση των θραυσμάτων. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ποιοτική και ποσοτική ανίχνευση των επιμέρους πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο μηχανισμό NHEJ, καθώς και ο προσδιορισμός της δραστηριότητας του μηχανισμού στα κύτταρα μυελού των οστών ασθενών με νεοδιαγνωσθέν πρωτοπαθές ΜΔΣ. Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν 48 ασθενείς με πρωτοπαθές μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο. Η ανάλυση της έκφρασης των ενζύμων που συμμετέχουν στο μηχανισμό NHEJ έγινε με τη μέθοδο αποτύπωσης κατά Western. Οι πρωτεΐνες που μελετήθηκαν είναι οι ακόλουθες:Ku70, Ku80, DNA-PKcs, XRCC4, Ligase IV. Τα ευρήματα της αποτύπωσης κατά Western επιβεβαιώθηκαν με διπλή ανοσοϊστοχημική μελέτη. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός της δραστηριότητας NHEJ σε εκχυλίσματα κυττάρων CD34+ από μυελό των οστών ενός μέρους του συνόλου των ασθενών. Η διεργασία αυτή έγινε με την εισαγωγή τους στα κατάλληλα πλασμίδια, πολλαπλασιασμό τους με τη μέθοδο Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυμεράσης (PCR amplification) , πέψη του DNA με διάφορα περιοριστικά ένζυμα, και σύγκριση του προτύπου των παραγομένων ζωνών με το φυσιολογικό πρότυπο που αναμένεται σε ακεραιότητα της λειτουργίας του μηχανισμού NHEJ. Η μέση τιμή έκφρασης της πρωτεΐνης Ligase IV βρέθηκε να είναι στατιστικώς σημαντικά χαμηλότερη στους ασθενείς με ΜΔΣ σε σχέση με τους μάρτυρες (0,53 αντί 0,78, p=0,036). Παρατηρήθηκε μια θετική συσχέτιση μεταξύ των τιμών έκφρασης της πρωτεΐνης Ku70 και του ποσοστού των βλαστών σε στατιστικώς σημαντικό βαθμό (p= 0,04). Αντιθέτως, βρέθηκε αρνητική συσχέτιση ανάμεσα στα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Ku80 και του ποσοστού των βλαστών, σε βαθμό που πλησίασε το όριο στατιστικής σημαντικότητας (p= 0,07). Επιπλέον, σημειώθηκε στατιστικώς σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ των τιμών έκφρασης του ενζύμου Ku70 και των επιπέδων αιμοσφαιρίνης (p=0,05). Επιπροσθέτως, παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ των τιμών έκφρασης της Ligase IV και της ομάδας καρυοτύπου, αναδεικνύοντας ότι ασθενείς με υψηλότερη τιμή Ligase IV είχαν καρυότυπο καλής πρόγνωσης (p=0,05.) Αντιθέτως, όσον αφορά το ένζυμο Ku70, τα επίπεδα έκφρασης ήταν χαμηλότερα σε ασθενείς με καρυότυπο καλής πρόγνωσης, σε στατιστικώς σημαντικό βαθμό (p=0,04). Παρόμοιο φαινόμενο παρατηρήθηκε και στις ομάδες IPSS (p=0,07). Όσον αφορά στον έλεγχο της ακεραιότητας του NHEJ, όλα τα δείγματα ασθενών ΜΔΣ που ελέγχθηκαν για την ακεραιότητα του μηχανισμού εμφάνισαν ορθή επανένωση της βλάβης, δηλαδή ακέραιο μηχανισμό. Επιπλέον, δε διέφεραν από τους μάρτυρες, οι οποίοι παρουσίασαν το ίδιο μοντέλο επανένωσης. Από όσο είμαστε σε θέση να γνωρίζουμε, η μελέτη μας αποτελεί την πρώτη μελέτη που διερευνά το ρόλο του μηχανισμού NHEJ στην παθογένεση των ΜΔΣ σε επίπεδο πρωτεϊνών καθώς και η πρώτη που εξετάζει την ακεραιότητα του μηχανισμού ως σύνολο στα ΜΔΣ. Βρήκαμε, για πρώτη φορά, ότι η έκφραση της πρωτεΐνης Ligase IV είναι χαμηλότερη στους ασθενείς με ΜΔΣ σε σχέση με τους μάρτυρες σε στατιστικώς σημαντικό βαθμό. Επίσης, για πρώτη φορά αναδεικνύουμε συσχέτιση της πρωτεΐνης Ku70 με πιο επιθετική νόσο. Περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου των μηχανισμών επιδιόρθωσης του DNA στην παθογένεση των ΜΔΣ κρίνεται απαραίτητη.