Ο ρόλος της υπεροικογένειας των θειορεδοξινών στη ρύθμιση θεμελιωδών κυτταρικών λειτουργιών: λειτουργία του μιτοχονδριακού συστήματος της θειορεδοξίνης

Abstract

Researchers have recently focused on thiol-disulfide regulation, which is carried out by redox proteins, whose activities depend on an active site containing one or two active thiols. Among these proteins, two thiol-disulfide reductases stand out: thioredoxin (TRX) and glutaredoxin (GRX), which are members of the thioredoxin superfamily. HIF-1 consists of two subunits, HIF-1α and HIF-1β and it is a key regulator for adaptation to low oxygen availability. In this study, we used S- nitrosoglutathione (GSNO, considered the most physiological NO donor), which results in HIF-1α protein accumulation due to decreased ubiquitination and proteasomal degradation. We present evidence that overexpression of TRX2 or TRXR2 (TRX2 reductase) attenuates NO-evoked HIF-1α accumulation and transactivation of HIF-1 in HEK293 cells. In contrast, cytosolic-located TRX1 enhances HIF-1α protein amount and activity under NO treatments. S-glutathionylation is a post-translational modification that has emerged as a potential redox regulatory mechanism of protein activity and associated cellular functions. Reversibility of glutathionylation is critical in determining the physiological relevance of glutathionylation as a means of protein regulation. In the present study, we investigated the role of cytoplasmic GRX1 on certain pathways of innate immunity. For this scope, we used HEK293 and HeLa cell lines stably underexpressing GRX1. The first pathway we dealt with is the one triggered by IL-1R. TRAF6 is a critical intermediate signaling molecule involved in the above cascade. We found that TRAF6 with an intact RING-finger motif is S-glutathionylated under normal conditions. Moreover, upon IL-1 stimulation TRAF6 undergoes deglutathionylation catalysed by GRX1. The deglutathionylation of TRAF6 is essential for its K63-linked auto-polyubiquitination and subsequent activation of NF-κΒ. We also investigated the role of GRX1 on the induction of interferon β (IFNβ) by Sendai virus. IRF3 is an essential transcriptional regulator of the interferon genes. In this study, we report that in non-infected cells IRF3 is post-translationally modified by S-glutathionylation. Upon viral-infection, it undergoes a deglutathionylation step that is controlled by GRX1. Actually, deglutathionylation of IRF3 is necessary for efficient interaction of IRF3 with CBP, an event essential for transcriptional activation of the interferon genes.

Τα τελευταία χρόνια οι ερευνητές έχουν εστιάσει την προσοχή τους στη ρύθμιση θειόλης-δισουλφιδίου, η οποία πραγματοποιείται από οξειδοαναγωγικές πρωτεΐνες, μεταξύ των οποίων ξεχωρίζουν δύο αναγωγάσες θειόλης-δισουλφιδίου: η θειορεδοξίνη (TRX) και η γλουταρεδοξίνη (GRX). Ο HIF-1 αποτελείται από δύο υπομονάδες, τις HIF-1α και HIF-1β και συνιστά πρωταγωνιστικό ρυθμιστή στην προσαρμογή στην υποξία. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήσαμε την S- nitrosoglutathione (GSNO), που θεωρείται ένας από τους πιο φυσιολογικούς δότες ΝΟ και οδηγεί σε συσσώρευση της HIF-1α. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η υπερέκφραση της TRX2 ή της TRXR2 (της αναγωγάσης της TRX2) σε HEK293 κύτταρα εμποδίζει τη ΝΟ-επαγόμενη συσσώρευση της HIF-1α, καθώς και την ικανότητα ενεργοποίησης της μεταγραφής του HIF-1. Αντίθετα, η TRX1 ενισχύει την ποσότητα της HIF-1α πρωτεΐνης και τη δράση του HIF-1 μετά τη χορήγηση NO. Η S-γλουταθειονυλίωση αποτελεί μία μετα-μεταφραστική τροποποίηση που αναδεικνύεται σε οξειδοαναγωγικό ρυθμιστικό μηχανισμό της πρωτεϊνικής ενεργότητας και των σχετιζόμενων κυτταρικών λειτουργιών. Η αναστρεψιμότητα της γλουταθειονυλίωσης από την GRX1 αποτελεί βασικό κριτήριο για να θεωρηθεί ρυθμιστικός μηχανισμός. Στην παρούσα εργασία διερευνήσαμε το ρόλο της κυτταροπλασματικής GRX1 σε μονοπάτια ενδογενούς ανοσίας. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε HEK293 και HeLa κυτταροσειρές που υποεκφράζουν την GRX1. Το πρώτο μονοπάτι με το οποίο ασχοληθήκαμε είναι αυτό που κινητοποιείται από τον IL-1R, όπου πρωταγωνιστικό ρόλο κατέχει ο TRAF6. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο ανενεργός TRAF6 με ακέραιο RING μοτίβο είναι S-γλουταθειονυλιωμένος και ότι μετά την ενεργοποίηση με IL-1 καταλύεται η απογλουταθειονυλίωσή του από την GRX1. Επίσης, το βήμα αυτό είναι απαραίτητο για την Κ63-αυτό-πολυουβικιτίνωσή του και την επακόλουθη ενεργοποίηση του NF-κΒ. Το δεύτερο μονοπάτι ενδογενούς ανοσίας στο οποίο διερευνήσαμε το ρόλο της GRX1 είναι αυτό της επαγωγής της ιντερφερόνηςβ (IFNβ) από το Sendai virus. Ο IRF3 αποτελεί έναν σημαντικό μεταγραφικό ρυθμιστή των γονιδίων της ιντερφερόνης. Η μελέτη μας έδειξε ότι ο ανενεργός IRF3 είναι S-γλουταθειονυλιωμένος. Κατά την ιική μόλυνση απογλουταθειονυλιώνεται από την GRX1, προκειμένου να αλληλεπιδράσει με το CBP και να προωθήσει τη μεταγραφή του γονιδίου της IFNβ.