Μελέτη των μυκοβακτηριδίων στην Κρήτη. Ανίχνευση, ταυτοποίηση, φαινοτυπικός και γονοτυπικός έλεγχος ευαισθησίας

Abstract

The present report evaluated all the samples referred to the Mycobacteriology laboratory of the University Hospital of Heraklion from January 2000 to December 2007. The purpose of the study was to determine methods for rapid and reliable diagnosis of mycobacterioses, especially tuberculosis, to evaluate the combined use of conventional and molecular techniques and to analyze demographic features of these infections. A total of 9542 consecutive specimens were stained with Ziehl-Neelsen stain, cultured on Lowenstein-Jensen (L-J) slants as well as in the BacT/Alert 3D system. Furthermore, three of the most recent commercial molecular assays (GenProbe, bio-Merieux, GenoType Mycobacterium Direct and Genotype MTBDRPlus, Hein-lifescience) were conducted and analyzed for direct detection of MTBC in respiratory and non-respiratory specimens. Their performance and usefulness, not only on smear-positive samples, but also on selected smear-negative specimens, for whom the degree of suspicion of TB was high, was emphasized. Mycobacterium tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria (NTM) were identified by Accuprobe (bio-Merieux) and GenoType Mycobacterium CM, AS and MTBC (Hein-lifescience). For identification and confirmation of new and rare strains, the two “gold” standard methods: sequencing of 16SrRNA and analysis of the heat-shock 65 kd gene by PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) were used. Resistance to first-line antituberculous drugs was determined by the conventional proportional method on L-J medium and by the automated BacT/Alert 3Dsystem.Two new molecular assays, GenoType MTBDRPlus and GenoType MTBDRsl (Hein-lifescience), for rapid detection of genes involved in resistance in MTBC isolates were evaluated. Particularly, the GenoType MTBDRPlus detects mutations conferring resistance to rifampicine (rpoB) and isoniazid (katG and inhA), while the MTBDRsl permits the detection of resistance to fluoroquinolones, aminoglycosides and ethambutol by testing mutations in the genes gyrA, rrs and embB respectively, Drug sensitivity testing for non-tuberculous mycobacteria (NTM) was performed by the E-test method. A total of 320 mycobacterial strains were isolated including 179 MTBC and 141 NTM strains belonging to 19 mycobacterial species (51 rapid and 90 slow-growing). From the 179 MTBC only one was identified as M. bovis and 178 as M. tuberculosis. The analysis of the 51 rapid-growing mycobacteria revealed: 26 M. fortuitum, 9 M. peregrinum, 7 M. chelonae, 5 M, abscessus, 1 M. thermoresistible, 2 M. mucogenicum and 1 M.europaen. The first isolation of M. thermoresistible in Europe and seventh globally, is reported. The mycobacterium strain GN-10643, together with two similar strains isolated in Europe, establish a new strain named M. europaeum. The 90 slow-growing mycobacteria consisted of 24 M. avium, 4 M. intracellulare, 1 M. scrofulaceum, 4 M. kansasii, 1 M. marinum, 1 M. malmonse, 1 M. xenopi, 10 M. lentiflavum, 29 M. gordonae, 2 M. arupense, 12 M. GN01 (M. herakleense), 1M. GN-9680 (M. hellenicum). A new strain is reported and named M. herakleense sp. nov. because of the place of its first isolation and discovery. A second new one strain M. GN-9680 was isolated and studied. Furthermore, a third new, rapid-growing mycobacterium strain, discovered during the study period was named M. create (M. GN-11124). Also, two rare, non-tuberculous mycobacteria M. arupense were isolated and identified (M. GN-9722and M. GN-10546). The sequences of the new strains and of the rare ones were deposited in the GenBank. The three new species were also deposited to International Public Collections for preservation and investigation. Drug susceptibility testing of all non-tuberculous mycobacteria was performed using E-test method (AB Biodisk, Solna, Sweden), according to the manifacturer’s instructions. A total of 132 (73,7%) positive samples were obtained from native Greeks and 47 (26,3%) from immigrants originated from 11 countries (Bulgaria 15, Romania 10, Albania 9. Georgia 4, Ukraine 2, India 2, and Finland, Kenya, Uganda and Nigeria one isolate each. One additional patient was of Kurdish origin).Drug susceptibility testing (DST) showed that 146 (81,6%) isolates were susceptible to all anti-tuberculosis agents, while 33 (18,4%) were resistant to one or more drugs, and only one (0,56%) was found MDR. Resistant to isoniazid (INH) increased significantly over the two study periods from 2,9% over the years 2000-2003 to 16% over the period 2004-2007 (p=0,002). No significant increase in the rate of resistance to rifampicin ( RMP), ethambutol (EMB), streptomycin (SM), piraziamid (PYR) or para-amino-salicylic acid (PAS) was seen. Resistance to ?2 anti-tuberculous drugs rose over the two study periods from 2,9% to 12%, a significant increase (p=0,03). The overall INH-resistance rate of M. tuberculosis strains isolated from Greeks was 5,3% (7/132), while among immigrants was 17% (8/47, p=0,02). No significant difference in RMP and EMB was seen between Greeks and immigrants. On the other hand, SM resistance was significant higher in immigrants (9/47 versus 8/132, p=0,017), and this was the case with PAS (0/132 in Greeks versus 3/47 in immigrants, p=0,017). The concordance rates of DST and GenoType MTBDRPlus assay for INH and RMP resistance were 93,3% (14/15) and 100% (1/1), respectively. Strengthened surveillance is necessary to control TB in our region, nevertheless the low level of MDR TB, because of the increasing rate of the general resistance.

Αντικείμενο της παρούσας μελέτης αποτελεί η έγκαιρη και ακριβής διάγνωση της φυματίωσης με βάση νέες μεθοδολογίες άμεσης ανίχνευσης του μυκοβακτηριδίου σε κλινικό δείγματα που αφορούν την ταυτοποίηση στελεχών και την ανίχνευση της αντοχής σε αντιμικροβιακούς παράγοντες. Η παρούσα μελέτη ανέλυσε όλα τα δείγματα που εστάλησαν στο Εργαστήριο Μυκοβακτηριολογίας του Πανεπιστημικού Νοσοκομείου Ηρακλείου για καλλιέργειες από τον Ιανουάριο 2000 έως το Δεκέμβριο 2007, χωρισμένες σε δύο επιμέρους τετραετείς περιόδους (α 2000-2003 και β 2004-2007,) και οι ασθενείς διαχωρίστηκαν σε δύο ομάδες, Έλληνες και μετανάστες για λόγους αναλυτικότερης επεξεργασίας και σύγκρισης δεδομένων. Με στόχο την γρήγορη και αξιόπιστη διάγνωση των μυκοβακτηριώσεων εφαρμόστηκαν σε συνδυασμό κλασσικές και σύγχρονες μοριακές τεχνικές, οι οποίες και αξιολογήθηκαν. Εξετάσθηκαν 9542 διαδοχικά δείγματα στα οποία πραγματοποιήθηκε οξεάντοχη χρώση, καλλιέργειες σε υλικό Lowenstein-Jensen και ενοφθαλμίστηκαν στο αυτοματοποιημένο σύστημα υγρών καλλιεργειών BacT/Alert 3D. Επιπλέον, διενεργήθηκαν και αξιολογήθηκαν στα ύποπτα και θετικά με οξεάντοχη χρώση δείγματα οι τρεις πιο σύγχρονες εμπορικές τεχνικές για άμεση ανίχνευσης μυκοβακτηριδίων σε δείγμα GenProbe (bioMerieux), GenoType MycobacteriumDirect και GenoType MTBDRplus (Hain-Lifescience). Για την ταυτοποίηση του M. tuberculosis και των άτυπων μυκοβακτηριδίων εφαρμόσθηκαν οι μέθοδοι υβριδισμού: Accuprobe (bioMerieux) και Genotype Mycobacterium CM και AS, και Genotype MTBC (Hain-Lifescience). Για την επιβεβαίωση των σπανίων και καινούργιων στελεχών χρησιμοποιήθηκαν δύο μέθοδοι αναφοράς: η μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας του 16S rRNA γονιδίου και η ανάλυση του γονιδίου heat shock 65kD με τη μεθοδολογία ανάλυσης πολυμορφισμού μήκους με περιοριστικές ενδονουκλεάσες ( Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP). Από τα ανωτέρω δείγματα απομονώθηκαν, τυποποιήθηκαν και ελέγχτηκαν για αντοχή 320 στελέχη που περιελάμβαναν 179 Mycobacterium tuberculosis complex και 141 άτυπα που ανήκαν σε 19 είδη μυκοβακτηριδίων (51 ταχέως και 90 βραδέως αναπτυσσόμενα). Από τα 179 Μ. tb.complex, το ένα τυποποιήθηκε ως Μ. bovis. Ο έλεγχος ευαισθησίας για τα στελέχη M. tuberculosis προσδιορίσθηκε με τη κλασική μέθοδο αναλογιών σε υλικό Lowenstein-Jensen και στο αυτοματοποιημένο σύστημα BacT/AlerT 3D. Εφαρμόσθηκαν και οι καινούργιες εξετάσεις ανίχνευσης γόνου αντοχής έναντι των αντιφυματικών φαρμάκων ριφαμπικήνη (RMP) και ισονιαζίδη (INH) (Genotype MTBDRplus) και της εθαμβουτόλης (ΕΜΒ), τις φλουοροκινολόνες και αμυνογλυκοσίδες (Genotype MTBDRsl). Οι δημογραφικές αναλύσεις έδειξαν ότι οι ασθενείς με φυματίωση που εξετάσθηκαν ήταν το 73,7% από την Κρήτη και οι υπόλοιποι από 11 χώρες. Εκατό σαράντα έξη στελέχη (81,%) ήταν ευαίσθητα σε όλα τα αντί-φυματικά φάρμακα ενώ 33 (18,4%) ήταν ανθεκτικά σε ?1 φάρμακο. Μόνο σε μία περίπτωση βρέθηκε πολυανθεκτικό στέλεχος (0,56%). Η αντοχή στην Ισονιαζίδη και σε ?2 αντιφυματικά φάρμακα αυξήθηκε σημαντικά από 2,9% στο 16% (p=0,002)και από 2,9% στο 12% (p=0,03) κατά τις δύο περιόδους. Βρέθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ Ελλήνων και μεταναστών όσον αφορά τις αντοχές έναντι ΙΝΗ, στρεπτομυκίνης και πάρα-αμινο-σαλικυλικού οξύ. Η αντιστοιχία των αποτελεσμάτων της μοριακής τεχνικής ανίχνευσης γόνων αντοχής MTBDRplus και την κλασική μέθοδο αναλογιών ήταν 93,3% και 100% για την ΙΝΗ και για τα πολυανθεκτικά στελέχη (MDR), αντίστοιχα. Παρότι η πολυανθεκτική φυματίωση βρέθηκε σε πολύ χαμηλά επίπεδα στην Κρήτη, η αυξανόμενη συχνότητα της γενικής αντοχής υπογραμμίζει την ανάγκη για βελτίωση της επιτήρησης της νόσου. Για τα άτυπα μυκοβακτηρίδια η αντοχή ελέγχτηκε με τη μέθοδο του Ε-test. Η ανάλυση των 51 ταχέως αναπτυσσόμενων μυκοβακτηριδίων έδειξε: 26 Μ. fortuitum, 9 M. peregrinum, 7 M. chelonae, 5 M. abscessus, 1 M. thermoresistible, 2 M. mucogenicum και 1 M. europaeum. Το στέλεχος Μ.thermoresistible είναι το πρώτο που έχει απομονωθεί στην Ευρώπη και το έβδομο παγκοσμίως. Το στέλεχος Μ.GN-10643, μαζί με άλλα δύο στελέχη, συνιστά καινούργιο είδος άτυπου μυκοβακτηρίδιου το οποίο ονομάσθηκε M.europaeum. Τα 90 βραδέως αναπτυσσόμενα μυκοβακτηρίδια περιελάμβαναν: 24 M. avium, 4 M. intracellulare, 1 M. scrofullaceum, 4 M. kansasii, 1 M. marinum,1 M. malmons, 1 M. xenopi, 10 M. lentiflavum, 29 M. gordonae, 2 M. arupense, 12 M. GN01 και M. GN-9680. Κατά τη διάρκεια της μελέτης ανακαλύφτηκαν στο εργαστήριο καινούργια στελέχη άτυπων μυκοβακτηριδίων και για το λόγο αυτό προτάθηκε η ονομασία τους σε:1) Mycobacterium herakleense (M.GN01), 2) Mycobacterium hellenicum, M.GN-9680, 3) Mycobacterium create (M.GΝ-11124). Επίσης, απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν τα δύο πολύ σπάνια άτυπα μυκοβακτηρίδια Μ. arupense (Μ.GN-9722 και M.GN-10546). Ta καινούργια στελέχη, όπως και τα πολύ σπάνια κατοχυρώθηκαν στη GenBank. Τα τρία καινούργια στελέχη κατατέθηκαν και σε δύο διαφορετικά, διεθνή κέντρα φύλαξης βακτηριδίων προς ερευνητική χρήση. Σε όλα τα άτυπα μυκοβακτηρίδια πραγματοποιήθηκε έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμυκοβακτηριακά φάρμακα με τη μέθοδο του Ε-test