Μοριακοί μηχανισμοί μεταγραφικής ρύθμισης του γονιδίου του μεμβρανικού μεταφορέα λιπιδίων ABCA1 στο ήπαρ

Abstract

Low levels of plasma HDL cholesterol are an independent risk factor for cardiovascular disease. The membrane ABCA1 transporter plays a key role in the biogenesis of HDL by promoting the efflux of cellular cholesterol and phospholipids to lipid-poor apolipoprotein A-I. Mutations in the ABCA1 gene lead to Tangier disease which is characterized by near absent plasma HDL levels, accumulation of foam cells in various tissues and a moderate increase in the incidence of atherosclerosis. Hepatic ABCA1 protein is the major source of plasma HDL while macrophage ABCA1 protects against foam cell formation and atherosclerosis. Thus, the induction of ABCA1 gene expression has been associated with the increase in functional plasma HDL levels and the protection from atherosclerosis. The best characterized and most significant mechanism of ABCA1 gene regulation is via the activation of the nuclear receptors LXRα/RXRα in response to cholesterol loading. The purpose of the present thesis was the study of the molecular mechanisms that affect the induction of the ABCA1 gene via the above-mentioned pathway as well as the identification of new regulatory elements and factors. Initially, we investigated the role of the transcription factor Sp1 which binds to the proximal ABCA1 gene promoter and is necessary for its basal activity in hepatic cells. We showed that, physical and functional interactions between Sp1 and the nuclear receptors LXRα/RXRα were required for the optimal induction of ABCA1 gene transcription in response to their ligands, oxysterols and retinoids. Next, we identified, for the first time, binding sites for the hepatic transcription factor FOXA2/HNF-3β in the ABCA1 gene promoter. Binding of FOXA2 to these sites repressed the basal ABCA1 gene transcription. Furthermore, we showed that binding of FOXA2 to the TATA-box of the ABCA1 gene promoter inhibited the induction by oxysterols and retinoids possibly via competition with the transcription initiation machinery which is assembled to this site. Finally, we investigated the functional promoter that is present in the first intron of the ABCA1 gene. We showed the transcription factor SREBP-1, which is activated by LXRα/RXRα heterodimers in response to oxysterols and retinoids, binds to multiple sites in the proximal intron 1 promoter region. One of these sites overlaps with an AP1 binding site which binds to the transcription factor JunB during monocyte differentiation to macrophages. The ABCG1 transporter, similarly to ABCA1, plays a key role in cholesterol efflux to mature HDL particles and in the protection against atherosclerosis. We investigated the role of a natural mutation in the ABCG1 gene promoter which was identified in the general population in the City of Copenhagen and is associated with increased incidence of ischemic heart disease, myocardial infarction and dyspnea. We showed that this mutation abolishes a binding site for the transcription factor Sp1 and inhibits the induction of the ABCG1 gene promoter by this factor. Understanding in depth the molecular mechanisms that regulate ABCA1 gene expression in the liver and the role of specific transcription factors in these processes is anticipated to lead to the development of new substances that will increase ABCA1 gene expression and as a result, plasma HDL levels, providing protection against atherosclerosis and cardiovascular disease.

Τα χαμηλά επίπεδα της HDL χοληστερόλης στο πλάσμα αποτελούν έναν ανεξάρτητο παράγοντα κιδύνου για την εμφάνιση καρδιαγγειακής νόσου. Ο μεμβρανικός μεταφορέας ABCA1 διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη βιογένεση της HDL προάγοντας την εκροή χοληστερόλης και φωσφολιπιδίων από τα κύτταρα προς τη φτωχή σε λιπίδια απολιποπρωτεΐνη Α-Ι. Μεταλλαγές στο γονίδιο ABCA1 προκαλούν τη νόσο Tangier η οποία χαρακτηρίζεται από σχεδόν ανύπαρκτα επίπεδα HDL στο πλάσμα, συσσώρευση αφρωδών κυττάρων σε ποικίλους ιστούς και σχετικά μέτρια αύξηση στο ρυθμό εμφάνισης αθηροσκλήρωσης. Η πρωτεΐνη ABCA1 στο ήπαρ αποτελεί την κύρια πηγή της HDL στο πλάσμα ενώ η δράση της ABCA1 στα μακροφάγα προστατεύει από το σχηματισμό αφρωδών κυττάρων και την αθηροσκλήρωση. Κατά συνέπεια, η αύξηση της έκφρασης του γονιδίου ABCA1 έχει συνδεθεί με την αύξηση των επιπέδων λειτουργικής HDL χοληστερόλης στο πλάσμα και την προστασία από την αθηροσκλήρωση. Ο κύριος μηχανισμός επαγωγής της έκφρασης του γονιδίου ABCA1 είναι μέσω της ενεργοποίησης των πυρηνικών υποδοχέων LXRα/RXRα από οξυστερόλες και ρετινοειδή. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη των μοριακών μηχανισμών που επηρεάζουν την επαγωγή του γονιδίου ABCA1 μέσω του παραπάνω μονοπατιού καθώς και η ταυτοποίηση νέων ρυθμιστικών στοιχείων και παραγόντων. Αρχικά, εξετάσαμε το ρόλο του μεταγραφικού παράγοντα Sp1 ο όποιος βρέθηκε να προσδένεται στον υποκινητή του γονιδίου ABCA1 και να είναι απαραίτητος για τη βασική μεταγραφή του γονιδίου. Παρουσία οξυστερολών και ρετινοειδών η φυσική και λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ του Sp1 και των υποδοχέων LXRα/RXRα ήταν απαραίτητη προκειμένου να επιτευχθεί η βέλτιστη επαγωγή του γονιδίου ABCA1. Στη συνέχεια, ταυτοποιήσαμε για πρώτη φορά θέσεις πρόσδεσης για το ηπατικό μεταγραφικό παράγοντα FOXA2/HNF-3β στον υποκινητή του γονιδίου ABCA1. Η πρόσδεση του FOXA2 στις θέσεις αυτές είχε κατασταλτικό ρόλο στη βασική μεταγραφή του γονιδίου ABCA1. Επιπλέον αποδείξαμε ότι η πρόσδεση του FOXA2 στο στοιχείο ΤΑΤΑ του υποκινητή του γονιδίου ABCA1 μείωσε την επαγωγή από οξυστερόλες και ρετινοειδή μέσω ανταγωνισμού με τη βασική μεταγραφική μηχανή που συναρμολογείται σε αυτό το στοιχείο. Τέλος, εξετάσαμε την περιοχή του 1ου ιντρονίου του γονιδίου ABCA1 η οποία περιλαμβάνει ένα λειτουργικό υποκινητή. Αποδείξαμε ότι η περιοχή του 1ου ιντρονίου περιέχει θέσεις πρόσδεσης για το μεταγραφικό παράγοντα SREBP-1 ο οποίος ενεργοποιείται από τους LXRα/RXRα ως απόκριση στις οξυστερόλες και τα ρετινοειδή. Επιπλεόν, παρατηρήσαμε ισχυρή ενεργοποίηση της περιοχής του 1ου ιντρονίου του γονιδίου ABCA1 από τον παράγοντα JunB κατά την διαφοροποίηση των μονοκύτταρων σε μακροφάγα. Ο μεταφορέας ABCG1, όμοια με τον ABCA1, παίζει ρόλο στην εκροή της χοληστερόλης προς ώριμα σωματίδια HDL και στην προστασία από την αθηροσκλήρωση. Εξετάσαμε το ρόλο μιας φυσικής μεταλλαγής στον υποκινητή του γονιδίου ABCG1 που εντοπίστηκε στον πληθυσμό της Κοπεγχάγης, η οποία σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο για έμφραγμα του μυοκαρδίου και ισχαιμικά επεισόδια και με δύσπνοια. Αποδείξαμε ότι η μεταλλαγή αυτή καταστρέφει μια θέση πρόσδεσης για τον παράγοντα Sp1 και εμποδίζει την επαγωγή του υποκινητή του γονιδίου ABCG1 από αυτόν τον παράγοντα. Η σε βάθος κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που ρυθμίζουν την έκφραση του γονιδίου της ABCA1 στο ήπαρ και ο ρόλος συγκεκριμένων παραγόντων σε αυτές τις διαδικασίες αναμένεται να οδηγήσει στην δημιουργία νέων ουσιών που θα αυξάνουν την έκφραση του ABCA1 και κατά συνέπεια τα επίπεδα της HDL στο πλάσμα, προσφέροντας έτσι προστασία από την αθηροσκλήρωση και την καρδιαγγειακή νόσο.