Μελέτη των πολυσακχαριτών των κυτταρικών τοιχωμάτων πρωτοπλαστών και κάλλων των φυτών Trigonella foenum-graecum l. και Ceratonia siliqua l.: δυναμική της σύνθεσης γαλακτομαννάνης

Abstract

In the present Thesis, protoplasts and calli cultures from fenugreek {Trigonellafoenum-graecum L.) and carob (Ceratonia siliqua L.) were developed. These two species synthesize galactomannan, which they reserve in their endosperm cell walls. Protoplasts were isolated from fenugreek leaves and for the first time from carobseedlings and developing endosperms. Seedling parts (cotyledons, hypocotolys, roots) and developing carob and fenugreek endosperms were used as expiants for calli development. The composition of non cellulosic cell wall polysaccharides, the incorporation of D-[U-14C]glucose, D-[U-14C]mannose and [2-3H]mannose into protoplasts cell walls and culture medium polysaccharides and the potential of galactomannan biosynthesis were studied. Microtubules organisation during cell wall regeneration by carob hypocotyl hook protoplasts was studied as well. The main results of the present Thesis are in brief the following: 1) A method for trucking the presence of glucuronomannan was developed and for the first time glucuronomannan was found in protoplasts cell walls; in cell walls regenerated by carob hypocotyl hook protoplasts. 2) Protoplasts isolated from developing carob endosperms synthesized galactomannan, part of which was secreted in the culture medium. The rate of galactomannan biosynthesis was reduced during the course of protoplast culture while that of other polysaccharides (containing arabinose, galactose, xylose and glucose) was increased. A similar alteration was found in the case of cultured developing endosperms. 3) Regenerated cell walls were rich in non-cellulosic glucose; at least part of it belonged to callose. In the cell walls that were regenerated by fenugreek leaves and carob seedling protoplasts, mannopolysaccharides (with ßmannose) were found. Xyloglucans were found (after hydrolysis with driselase) in cell wall and culture medium polysaccharides. 4) Protoplasts from carob hypocotyl hook secreted arabinogalactan, rhamnogalacturonan I and hydrocarbons with low molecular weight in their culture medium. 5) Fresly isolated protoplasts, had numerous disorgansised microtubules, mainly cortical. During protoplast culture and cell wall regeneration, microtubules reorganised in parallel orientation and were centered on cortical foci. 6) Calli from developing endosperms were developed only under the presence of cytokinins and only when endosperms 28, 29, 30, 31 and 32 WAA (weeks after anthesis) were used as expiants. The percentage of callogenesis from developing fenugreek endosperms was extremely low under the culture conditions tested. 7) The amount of the various monosaccharides in the calli cell wall polysaccharides varied and depended upon the species and the kind of expiant. Calli that were developed from carob tissues contained more arabinose comparing with the calli that were developed from fenugreek. 8) Calli from developing fenugreek endosperms contained more non cellulosic polysaccharides compairing with calli from seedlings and synthesized galactomannan after 14 months of culture. In vitro cultures (developing carob endosperms in culture, protoplasts from developing carob endosperms and calli form developing fenugreek endosperms) from tissues that were characterized by galactomannan biosythesis retained for certain period of culture this ability. In contrast, cell walls of calli form carob and fenugreek seedlings, as well as those regenerated from carob hypocotyl and fenugreek leaves protoplasts contained a few mannopolysaccharides and a variety of other polysaccharides (callose, xyloglucans, arabinogalactans e.tc.) In vitro cultures able to synthesize galactomannan could be an excellent experimental tool for studies on the regulation of galactomannan biosynthesis.

Στα πλαίσια της παρούσης διατριβής αναπτύχθηκαν καλλιέργειες πρωτοπλαστών και καλλών από ιστούς τριγωνίσκου (Trigonella foenum-graecum L.) και χαρουπιάς (Ceratonìa siliqua L.). Τα δύο αυτά φυτικά είδη συνθέτουν γαλακτομαννάνη, την οποία αποταμιεύουν στα κυτταρικά τοιχώματα των ενδοσπερμίων τους. Πρωτοπλάστες απομονώθηκαν από υποκοτύλια αρτιβλάστων και από αναπτυσσόμενα ενδοσπέρμια χαρουπιάς, για πρώτη φορά, καθώς και από φύλλα τριγωνίσκου και διερευνήθηκαν οι κατάλληλες συνθήκες ώστε να αναγεννήσουν κυτταρικό τοίχωμα. Ως έκφυτα για την ανάπτυξη κάλλων χρησιμοποιήθηκαν τμήματα αρτιβλάστων (κοτυληδόνες, υποκοτύλια και ριζίδια) και, για πρώτη φορά, αναπτυσσόμενα ενδοσπέρμια τριγωνίσκου και χαρουπιάς.Αναλύθηκε η σύσταση των μη κυτταρινικών πολυσακχαριτών των κυτταρικών τοιχωμάτων και μελετήθηκε η ενσωμάτωση της ϋ-[υ-140]γλυκόζης, D-[U-1 0]μαννόζης και [2-3Η]μαννόζης στους πολυσακχαρίτες των κυτταρικών τοιχωμάτων και σε αυτούς του μέσου καλλιέργειας των πρωτοπλαστών. Επιπλέον διερευνήθηκε η δυναμική σύνθεσης γαλακτομαννάνης και μελετήθηκε η διάταξη των μικροσωληνίσκων κατά την αναγέννηση του κυτταρικού τοιχώματος στους πρωτοπλάστες των υποκοτυλιακών αγκίστρων χαρουπιάς.Τα σημαντικότερα αποτελέσματα της παρούσης διατριβής συνοψίζονται στα ακόλουθα: 1) Αναπτύχθηκε μέθοδος για την ανίχνευση της παρουσίας γλυκουρονομαννανών, και εντοπίστηκαν για πρώτη φορά γλυκουρονομαννάνες σε κυτταρικά τοιχώματα πρωτοπλαστών και συγκεκριμένα σε αυτά που αναγέννησαν οι πρωτοπλάστες από υποκοτυλιακά άγκιστρα χαρουπιάς 2) Πρωτοπλάστες που απομονώθηκαν από αναπτυσσόμενα ενδοσπέρμια χαρουπιάς συνέθεταν γαλακτομαννάνη, μέρος της οποίας εξέκριναν στο μέσο καλλιέργειας. Με την πάροδο του χρόνου καλλιέργειας, η σύνθεση της γαλακτομαννάνης μειώθηκε, ενώ αυξήθηκε η σύνθεση άλλων πολυσακχαριτών, όπως αραβινογαλακτανών και ξυλογλυκανών. Παρόμοια μεταβολή της σύστασης των κυτταρικών τοιχωμάτων παρατηρήθηκε και σε καλλιεργούμενα αναπτυσσόμενα ενδοσπέρμια. 3) Η αναγέννηση κυτταρικού τοιχώματος από τους πρωτοπλάστες ήταν ανεξάρτητητης παρουσίας ορμονών στο μέσο καλλιέργειας. Τα κυτταρικά τοιχώματα των πρωτοπλαστών ήταν πλούσια σε μη κυτταρινική γλυκόζη, μέρος τουλάχιστον της οποίας ανήκε στην καλλόζη. Στα κυτταρικά τοιχώματα που αναγέννησαν οι πρωτοπλάστες από φύλλα τριγωνίσκου και από αρτίβλαστα χαρουπιάς διαπιστώθηκε η παρουσία μαννοπολυσακχαριτών με β-μαννόζη. Στους πολυσακχαρίτες των κυτταρικών τοιχωμάτων (αλλά και του μέσου καλλιέργειας) περιέχονταν ξυλογλυκάνες, όπως πιστοποιήθηκε μετά από πέψη με δρισελάση. 4) Στο μέσο καλλιέργειας των πρωτοπλαστών από υποκοτυλιακά άγκιστρα χαρουπιάςεκκρίθηκαν αραβινογαλακτάνες, ραμνογαλακτουρονάνη Ι, καθώς και υδρογονάνθρακες με μικρό μοριακό βάρος. Στο μέσο καλλιέργειας των πρωτοπλαστών από φύλλα τριγωνίσκου εκκρίθηκαν πολυσακχαρίτες πλούσιοι σε γλυκόζη.5) Οι πρωτοπλάστες αμέσως μετά την απομόνωση τους διέθεταν πολλούς μικροσωληνίσκους, κυρίως περιφερειακούς και τυχαία διαταγμένους. Στους καλλιεργούμενους πρωτοπλάστες, κατά την αναγέννηση του κυτταρικού τοιχώματος, οι περιφερειακοί μικροσωληνίσκοι αναδιοργανώθηκαν και διευθετήθηκαν παράλληλα, πιθανόν με τη βοήθεια περιφερειακών θέσεων όπου συνέκλιναν. 6) Κάλλοι από αναπτυσσόμενα ενδοσπέρμια χαρουπιάς αναπτύχθηκαν μόνο παρουσία κυτοκινίνης και από ενδοσπέρμια ηλικίας 28, 29, 30, 31 και 32 εβδομάδων μετά την άνθιση. Το ποσοστό της καλλογένεσης από αναπτυσσόμενα ενδοσπέρμια τριγωνίσκου ήταν εξαιρετικά μικρό στις συνθήκες που δοκιμάστηκαν. 7) Η ποσότητα των διαφόρων μονοσακχαριτών στους πολυσακχαρίτες των κυτταρικών τοιχωμάτων των διαφόρων κάλλων ποίκιλλε, ανάλογα με το φυτικό είδος, αλλά και ανάλογα με το είδος του εκφύτου. Κάλλοι που αναπτύχθηκαν από ιστούς χαρουπιάς περιείχαν περισσότερη αραβινόζη από τους κάλλους που αναπτύχθηκαν από ιστούς τριγωνίσκου. 8) Οι κάλλοι από αναπτυσσόμενα ενδοσπέρμια τριγωνίσκου περιείχαν στα κυτταρικά τους τοιχώματα περισσότερους μη κυτταρινικούς πολυσακχαρίτες σε σχέση με τους κάλλους από αρτίβλαστα και συνέθεταν γαλακτομαννάνη μετά από δεκατέσσερις μήνες ανακαλλιεργειών. In vitro καλλιέργειες (αναπτυσσόμενα ενδοσπέρμια χαρουπιάς σε καλλιέργεια, πρωτοπλάστες από αναπτυσσόμενα ενδοσπέρμια χαρουπιάς και κάλλοι από αναπτυσσόμενα ενδοσπέρμια τριγωνίσκου) από ιστούς, που χαρακτηρίζονταν από ενεργό το μεταβολικό μονοπάτι σύνθεσης γαλακτομαννάνης, διατήρησαν, για ορισμένα χρονικά διαστήματα, την ικανότητα των εκφύτων να συνθέτουν γαλακτομαννάνη. Αντίθετα, τα κυτταρικά τοιχώματα καλλών από αρτίβλαστα τριγωνίσκου και χαρουπιάς, από αναπτυσσόμενα ενδοσπέρμια χαρουπιάς, καθώς και αυτά που αναγέννησαν πρωτοπλάστες από υποκοτυλιακά άγκιστρα χαρουπιάς και από φύλλα τριγωνίσκου, περιείχαν λίγους μαννοπολυσακχαρίτες και ποικιλία άλλων πολυσακχαριτών (καλλόζη, ξυλογλυκάνες, αραβινογαλακτάνες κ.ά). Οι in vitro καλλιέργειες, οι οποίες συνθέτουν γαλακτομαννάνη, μπορούν να αξιοποιηθούν στις μελέτες της ρύθμισης της παραγωγής της.