Βιοχημική και ανοσολογική μελέτη της δράσης των αυξητικών παραγόντων στη σύνθεση μεμβρανικών και εκκρινόμενων πρωτεογλυκανών σε κυτταρικές σειρές ινοσαρκώματος και φυσιολογικών ινοβλαστών

Abstract

Fibrosarcoma is an uncommon tumor with a rich extracellular matrix, there are no specific biomarkers for its diagnosis. Versican, a large chondroitin sulphate proteoglycan and hyaluronan (HA), a non-sulphated glycosaminoglycan are major constituents of the pericellular matrix. Inmany neoplastic tissues, changes in the expression of versican and HAaffect tumour progression. In this study, it was analysed the synthesis of versican and hyaluronan by fibrosarcoma cells, and document how the latter is affected by PDGF-BB, bFGF and TGFB2, growth factors endogenously produced by these cells. Fibrosarcoma cell lines B6FS and HT1080were utilised and compared with normal lung fibroblasts (DLF). The major versican isoforms expressed by DLF and B6FS cells were V0 and V1. Treatment of B6FS cells with TGFB2 showed a significant increase ofV0 and V1mRNAs. Versican expression in HT1080 cells was not significantly affected by any of the growth factors. In addition, TGFB2 treatment increased versican protein in DLF cells. HA, showed approximately a 2-fold and a 9-fold higher production in DLF cells compared to B6FS and HT1080 cells, respectively. In HT1080 cells, HA biosynthesis was significantly increased by bFGF, whereas, in B6FS cells it was increased by TGFB2 and PDGF-BB. Furthermore, analysis of HA synthases (HAS) expression indicated that HT1080 expressed similar levels of all three HAS isoforms in the following order: HAS2N HAS3N HAS1. bFGF shifted that balance by increasing the abundance of HAS1. The major HAS isoform expressed by B6FS cells was HAS2. PDGFBB and TGFB2 showed the most prominent effects by increasing both HAS2 and HAS1 isoforms. In conclusion, these growth factors modulated, through upregulation of specific HAS isoforms, HA synthesis, secretion and net deposition to the pericellular matrix. Syndecan-1 is suggested to participate in the regulation of a number of cellular processes such as cell proliferation and migration. Recent studies have suggested the putative mechanisms of synmdecan-1 cytoplasmic, transmembrane and extracellular domain action on cell functions and signal transduction. The aim of this study was to investigate the effect of specific syndecan-1 domains on fibrosarcoma cell migration and proliferation. Transfected B6FS fibrosarcoma cells with full length (FL/EGFP)of syndecan-1 construct, a variant coding for the endodomain (77/EGFP) and a variant coding for the RMKKK cytoplasmic sequence, were used. The expression and cellular localization of the FL, 77 and RMKKK recombinant proteins was analysed using confocal microscopy, after six weeks selection 1 5 using geneticin (400μg/ml). Recombinant FL/EGFP showed cell membrane reactivity while RMKKK/EGFP showed distinct nuclear localization. The overexpression of 77/EGFP that lacks the ectodomain resulted in altered morphology, the cells became smaller and rounded. The proliferation of transfected fibrosarcoma cells with the respective constructs was measured using WST-1 colorimetric reagent. Our results demonstrated that the expression of both full length and the two truncated recombinant proteins, compared to vector transfected cells, significantly inhibited fibrosarcoma cell proliferation. B6FS transfected with the 77/ EGFP and the RMKKK/EGFP constructs lack the ectodomain of syndecan-1, enhancing the suggestion that the syndecan-1 ectodomain is responsible for the stimulation of proliferation.Furthermore, we studied the effect of FL/EGFP, the endodomain 77/EGFP and the cytoplasmic RMKKK/EGFP recombinant proteins on the migrative response of B6FS fibrosarcoma cells. Our results demonstrated that B6FS cells transfected with FL/EGFP and RMKKK/EGFP constructs had an enhanced migration capability compared to EGFP vector transfected cells. In contrast, the expression of 77/EGFP recombinant protein inhibited B6FS cell migration. This study suggets that syndecan-1 ectodomain may have a “switch” function , resulting in activation of the cytoplasmic domain, after ligand binding. Platelet derived growth factor is involved in the autocrine growth stimulation of malignant cells, the stimulation of angiogenesis and the recruitment and regulation of tumor fibroblasts. PDGF has been shown to physically interact with glycosaminoglycans which are abundant in the fibrosarcoma cell microenvironment. Aim of the present study was to examine the effects of glycosaminoglycans on the mitogenic function of platelet derived growth factor in two human fibrosarcoma cell lines (B6FS, HT1080). For this purpose exogenously added glycosaminoglycans, regulators of endogenous glycosaminoglycan synthesis (sodium chlorate as selective inhibitor and β- D--xyloside as a stimulator) and specific glycosidases to cleave cell-associated glycosaminoglycans, were utilized. Platelet derived growth factor demonstrated a growth stimulating effect on B6FS, whereas no effect was evident on HT1080 fibrosarcoma cells. β-D-xyloside had no effect on the basal level or the platelet derived growth factor-induced cell proliferation, whereas sodium chlorate severely reduced the basal level of proliferation in both cell lines. Significant co-stimulatory effects of chondroitin sulfate A in combination with platelet derived growth factor BB on the growth of HT1080 and B6FS cells were found. The co-stimulatory effect of chondroitin sulfate A was not due to transcriptional up regulation of platelet derived growth factor receptors genes, but rather to more efficient signalling of tyrosine kinase receptors. In conclusion, this study shows that chondroitin sulfate A can enhance the mitogenic activity of platelet-derived growth factor in fibrosarcoma cells utilizing a pathway which involves tyrosine kinases. This result introduces a new modulating...

Το ινοσάρκωμα ορίζεται ως κακοήθης όγκος των μαλακών μορίων , αποτελούμενος από ινοβλάστες. Είναι ασυνήθης όγκος καθώς αριθμεί λιγότερο του 1% στους ενήλικες και του 7% όλων των παιδιατρικών κακοηθειών. Δεν υπάρχουν ανοσολογικοί δείκτες για αυτόν τον τύπο κυττάρων, με αποτέλεσμα η διάγνωση του ινοσαρκώματος με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους να γίνεται εξ αποκλεισμού από τους άλλους τύπους σαρκωμάτων. Οι πρωτεογλυκάνες είναι θειομένες πρωτεΐνες αποτελούμενες από έναν πρωτεινικό κορμό συνδεδεμένο με γλυκοζαμινογλυκάνες. Συμμετέχουν στη ρύθμιση σημαντικών κυτταρικών γεγονότων όπως, κυτταρική προσκόλληση, διήθηση, διαφοροποίηση και πολλαπλασιασμό. Συμμετέχουν επίσης στην οργάνωση του εξωκυττάριου χώρου μέσω των αλληλεπιδράσεων τους με σημαντικά μακρομόρια όπως, το κολλαγόνο, τις λιποπρωτεϊνες και τους αυξητικούς παράγοντες. Λίγα είναι γνωστά για τις PGs και GAGs στους όγκους των μαλακών μορίων. Όγκοι του στρώματος και όγκοι ινώδους ιστού περιέχουν PGs και GAGs σε υψηλότερα επίπεδα από ότι ο περιβάλλον ιστός. Η ανάπτυξη του καρκίνου ως εξέλιξη με πολλά βήματα χρειάζεται μεταξύ των άλλων και επιπλέον μελέτες για των χαρακτηρισμό της ανάμειξης των διαφόρων πρωτεογλυκανών σε κάθε βήμα των νεοπλασιών. Καθορισμός του ρόλου της κάθε πρωτεογλυκάνης και ξεχωριστά των εκκρινόμενων ή/και των συνδεδεμένων με την κυτταρική μεμβράνη πρωτεογλυκανών στους παθολογικούς μηχανισμούς. Η πληρέστερη ανάλυση της δομής των γλυκοζαμινογλυκανικών αλυσίδων πρέπει επίσης να συσχετίζεται με την παθολογική ανατομική. Πιστεύεται, ότι η γνώση της δομής και του ρόλου ειδικών πρωτεογλυκανών θα προσφέρει μηχανισμούς δράσης που θα βοηθήσουν την θεραπεία του καρκίνου. Για την μελέτη της έκφρασης των πρωτεογλυκάνων σε κύτταρα ινοσαρκώματος χρησιμοποιήσαμε ως βιολογικά μοντέλα δυο κυτταρικές σειρές ινοσαρκώματος από άνθρωπο την HT1080 και την B6FS. Τα κύτταρα ΗΤ1080 χαρακτηρίζονται ως επιθηλιακά, ενώ τα B6FS κύτταρα ως ινοβλαστοειδή, καθώς επίσης και φυσιολογικούς ινοβλάστες (DLF) απο πνεύμονα ανθρώπου. Ξεκινήσαμε με τον χαρακτηρισμό των πρωτεογλυκανών και των υποδοχέων των αυξητικών παραγόντων που εκφράζει η κάθε μια από τις κυτταρικές σειρές. Στη συνέχεια, μελετήσαμε την επίδραση των αυξητικών παραγόντων, και συγκεκριμένα των PDGF-BB, FGF, και TGF, στα επίπεδα των έκφρασης των πρωτεογλυκανών. Η περιοχή γύρω από το κύτταρο αποτελείται κυρίως από τη πρωτεογλυκάνη βερσικάνη και το υαλουρονικό οξύ που σχηματίζουν ένα σύμπλοκο. Σε πολλούς νεοπλαστικούς ιστούς η αλλαγή της έκφρασης της βερσικάνης και του υαλουρονικού οξέους σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου. Στον καρκίνο του μαστού και του προστάτη η αυξημένη έκφραση βερσικάνης στα στρωματικά κύτταρα και σε αυτά γύρω από τον όγκο χρησιμοποιείται σαν καρκινικός δείκτης. Συμπληρωματικά, αυξημένη έκφραση του υαλουρονικού οξέος σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου , του πνεύμονα και του μαστού. Στόχοι της μελέτης ήταν 1) ο χαρακτηρισμός των επιπέδων έκφρασης της βερσικάνης και του υαλουρονικού οξέος στα κύτταρα ινοσαρκώματοςκαι 2) η επίδραση των PDGF-BB, FGF, και TGF αυξητικών παραγόντων στη βιοσύνθεση των παραπανω. Οι κυτταρικές σειρές ινοσαρκώματος που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι HT1080 και B6FS...