Η ανάπτυξη της μεθόδου μικροσυστοιχιών πυρηνικού και μιτοχονδριακού δεσοξυριβονουκλεϊκού οξέος (DNA microarrays) στη μελέτη των μιτοχονδριακών νοσημάτων

Abstract

The pivotal role of mitochondria in cell energy metabolism and the complex nature of their genetic regulation, by both the nuclear and the mitochondrial DNA, form the basis for the diverse clinical presentation and the unique genetics of mitochondrial diseases. Moreover, primary or secondary mitochondrial dysfunction has been associated with the pathogenesis of a variety of conditions, such as obesity, diabetes, cancer, neurodegeneration, cardiomyopathy, depression and aging. Despite their significance, diagnostic tools for assessing mitochondrial function remain limited and labor intensive, as they involve biochemical analyses on muscle biopsy specimens and molecular testing, available only at limited specialized centers world-wide. The present work describes the development and first application of the microarray technology in studying mitochondrial genomics. We developed a human mitochondria-focused microarray, with 501 nuclear encoded genes related to mitochondrial structure, biogenesis and function. For the validation of that method we studied gene expression profiles in dexamethasone-treated primary human skeletal myocytes, as an in vitro model of steroid-induced myopathy. Changes were observed in the expression of genes involved in protein synthesis, fatty acid metabolism, oxidative stress and apoptosis, while the most significant finding was the induction of the gene encoding for monoamine oxidase-A (MAO-A). MAO-A is the primary enzyme metabolizing catecholamines, other neurotransmitters and dietary amines, and its role in skeletal muscle remains largely unexplored. We report a significant induction of MAO-A gene transcription and protein synthesis, followed by increased enzymatic activity, leading to downstream hydrogen peroxide production. We suggest that MAO-A mediated oxidative stress can lead to skeletal muscle cell damage, representing a novel pathogenetic mechanism for glucocorticoid-induced myopathy and a potential target for therapeutic intervention. The experience from this first application of the mitochondrial microarray led to the design and development of a more advanced version, the hMitChip3, which contains 1135 genes related to mitochondria, including the newly cloned mtDNA-encoded genes. We believe that the mitochondrial microarray represents a novel and reliable tool for studying mitochondrial genomics.

Ο στρατηγικός ρόλος του μιτοχονδρίου στο κύτταρο και η σύνθετη ρύθμιση της λειτουργίας του από γονίδια του μιτοχονδριακού αλλά και του πυρηνικού DNA, έχουν ως συνέπεια το τεράστιο εύρος κλινικών εκδηλώσεων και την ιδιαίτερη κληρονομικότητα, που χαρακτηρίζουν τα μιτοχονδριακά νοσήματα. Παράλληλα, μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, πρωτοπαθούς ή δευτεροπαθούς χαρακτήρα, έχει συσχετισθεί με πλειάδα παθήσεων, όπως παχυσαρκία, διαβήτης, καρκίνος, νευροεκφυλιστικά νοσήματα, καρδιοπάθειες, κατάθλιψη καθώς και τη διαδικασία της γήρανσης. Παρά τη σημασία τους, οι διαθέσιμες τεχνικές για τη μελέτη των μιτοχονδριακών νοσημάτων είναι περιορισμένες και επίπονες, καθώς περιλαμβάνουν βιοχημικές εξετάσεις σε υλικό μυϊκής βιοψίας και μοριακό έλεγχο, που είναι εφικτός σε λίγα μόνον εξειδικευμένα κέντρα διεθνώς. Η μελέτη αυτή περιγράφει την ανάπτυξη και την πρώτη εφαρμογή της μεθόδου των μικροσυστοιχιών DNA για τη μελέτη της μιτοχονδριακής γονιδιακής έκφρασης. Κατασκευάστηκε μια μικροσυστοιχία, αποτελούμενη από 501 γονίδια πυρηνικού DNA σχετιζόμενα με τη δομή, τη βιοσύνθεση και τη λειτουργία του μιτοχονδρίου. Για την αξιολόγηση της μεθόδου χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινα μυϊκά κύτταρα in vitro για τη διερεύνηση της επίδρασης των γλυκοκορτικοειδών στη μιτοχονδριακή λειτουργία, με απώτερο στόχο την κατανόηση των μοριακών μηχανισμών της μυοπάθειας από στεροειδή. Σημαντικές μεταβολές παρατηρήθηκαν στην έκφραση γονιδίων που συμμετέχουν στην πρωτεϊνοσύνθεση, το μεταβολισμό των λιπαρών οξέων, το οξειδωτικό stress και την απόπτωση, μεταξύ άλλων, ενώ σημαντικότερη ήταν η επαγωγή της μεταγραφής της μονοαμινοξειδάσης Α (ΜΑΟ-Α). Η ΜΑΟ-Α είναι το σημαντικότερο ένζυμο μεταβολισμού των κατεχολαμινών και άλλων νευρομεταβιβαστών, του οποίου ο ρόλος στο σκελετικό μυ παραμένει αδιευκρίνιστος. Η παρούσα μελέτη περιγράφει τη διέγερση της μεταγραφής, της μετάφρασης και της ενζυμικής δραστικότητας της ΜΑΟ-Α μετά από έκθεση μυϊκών κυττάρων σε γλυκοκορτικοειδή, με επακόλουθη αύξηση της παραγωγής υπεροξειδίου του υδρογόνου. Ο μεταβολικός αυτός δρόμος μπορεί να οδηγεί σε αύξηση του οξειδωτικού stress και κυτταρική βλάβη, συμβάλλοντας στην αιτιοπαθογένεια της μυοπάθειας από στεροειδή. Η εμπειρία από αυτήν την πρώτη εφαρμογή, οδήγησε στη βελτίωση του σχεδιασμού και την κατασκευή μιας νέας μιτοχονδριακής μικροσυστοιχίας με 1135 γονίδια σχετιζόμενα με το μιτοχόνδριο, συμπεριλαμβανομένων αυτών που κωδικοποιούνται από το μιτοχονδριακό DNA. Πιστεύουμε, πως η μιτοχονδριακή μικροσυστοιχία αποτελεί ένα αξιόπιστο και πρωτοποριακό εργαλείο για τη μελέτη της μιτοχονδριακής γονιδιωματικής.