Μελέτη του μηχανισμού δράσης των πρωτεϊνών Hu/Elavl σε λειτουργίες του ανοσοποιητικού και του κεντρικού νευρικού συστήματος

Abstract

The post-transcriptional regulation of many mRNAs is a critical step in the regulation of cellular and biochemical processes underlying physiological and pathological reactions. Aberrations in the post-transcriptional control of molecules involved in cellular differentiation, proliferation, stress and death may provide the impetus for the development of inflammatory, degenerative and autoimmune diseases as well as cancer. Post-transcriptional processes encompass several “machines” that promote the prudent execution of RNA splicing, nucleocytoplasmic trafficking, mRNA turnover and translation. At the molecular level, these machines are composed of RNA-binding proteins and microRNAs that interact with specific elements on the RNA body. In this dissertation, we focused on the functional role of the Hu/Elavl family of ribonucleoproteins which is comprised of the ubiquitously expressed HuR (Elavl1/HuA) and the neuron-specific HuB/HelN1, HuC and HuD. The prototype member of this family, HuR, has been examined in a number of unicellular settings; moreover it has been ascribed as a potent stability/translational controller of mRNAs possessing U and AU-rich elements which are known to be important in several cellular responses, including stress and immunity. Similarly, it has been proposed that both HuR and the neuronal Hu proteins are implicated in the synaptic plasticity of neurons by promoting the localized translation in axons and dendrites. Despite the wealth of information of the molecular attributes of Hu proteins, little is known about the true biological functions in vivo; with respect to HuR, this was due to its involvement in central developmental processes, as demonstrated by the embryonic lethality of obligatory mouse mutants. To circumvent this problem, we employed a series of tissue specific transgenic permutations in the mouse and aimed to identify the exclusive role of HuR either in a setting where it is solely expressed (e.g. cells of adaptive immunity or oligonden drogloia) or in the context of its co-expression to other Hu’s (neurons). More specifically, and in that context, we tried to identify the functional role of HuR: In the maturation and physiological/autoreactive response of Tlymphocytes In the degenerative excitotoxic response of neurons in the central nervous system (CNS) In the degenerative reaction of oligodendrogloia in the CNS. The functional role of HuR in adaptive immune responses was examined via its selective ablation from murine T lymphocytes in the thymus. The absence of HuR resulted in the increase of thymic cellularity, followed by a significant reduction mature Tlymphocytes in the peripheral lympoid tissues and particularly in the intestine. This complex phenotype was a consequence of HuR’s control over: (a) intrinsic signals that repress the cell cycle of immature thymocyte precursors, (b) extrinsic T-cell receptor/ antigenic signals driving the processes of positive selection and the negative selection of self-reactive T cells; (c) extrinsic pro-inflammatory cytokine and death signals regulating thymocyte deletion and (d) extrinsic chemotactic signals that control the migrations and exit of mature T-cells from the thymus to the periphery. Moreover, HuR regulated the biosynthesis of αΕ and β7 integrins for the colonization of the intestine by intraepithelial lymphocytes. Finally, our observations suggested a role for HuR in autoimmunity, which was validated further in the animal model of Multiple Sclerosis (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis), where the mutant mice showed reduced acute responses but conversion to a chronic-lethal-form.

Η μετα-μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης πολλών mRNA αποτελεί κομβικό ση- μείο ελέγχου στα κυτταρικά και βιοχημικά μονοπάτια που καθορίζουν τόσο τις φυσι- ολογικές όσο και τις παθολογικές αντιδράσεις των κυττάρων. Άρρυθμες μεταβολές στον μετα-μεταγραφικό έλεγχο της έκφρασης μορίων που εμπλέκονται στην διαφο- ροποίηση, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, το κυτταρικό στρες και τον κυτταρικό θάνατο μπορεί να προκαλέσει την ανάπτυξη φλεγμονωδών, εκφυλιστικών, αυτοάνο- σων και καρκινικών νοσημάτων. Ο μετα-μεταγραφικές διαδικασίες περιλαμβάνουν τους μηχανισμούς του ματίσματος, της πυρηνοκυτταροπλασματικής μεταφοράς, της αποσταθεροποίησης και της μεταφραστικής ικανότητας μορίων RNA και καθορίζο- νται από τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ RNA περιοχών με ριβονουκλεοπρωτεΐνες (RNA-binding proteins, RBPs) και μικρομοριακά RNA. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρωθήκαμε στη μελέτη του λειτουργικού ρόλου των πρωτεϊνών της οικογένειας Hu/Elavl. Η οικογένεια αυτών των πρωτεϊνών περιλαμβάνει την καθολικά εκφραζόμενη HuR (Elavl1/HuΑ) και τις νευροειδικές HuB/HelN1, HuC και HuD. Η πρωτεΐνη HuR αποτελεί το πρότυπο μέλος της οικο- γένειας αυτής και έχει δειχθεί να καθορίζει τη σταθερότητα και την μεταφραστική ικανότητα μορίων mRNA, τα οποία περιέχουν αλληλουχίες ουρακίλης ή/και αδενίνης (AU-rich elements, AREs) τα οποία διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στο κυτταρικό στρές και στις ανοσιακές αντιδράσεις. Αντίστοιχα, τόσο η ΗuR όσο και νευροειδικές Hu πρωτεΐνες ρυθμίζουν τη συναπτική πλαστικότητα μέσα από την τοποειδική μετά- φραση πολλών νευροειδικών mRNA πού βρίσκονται στους νευρικούς άξονες και τους δενδρίτες. Παρά την ύπαρξη σημαντικής πληροφορίας για τους μοριακούς μη- χανισμούς που εμπλέκονται οι πρωτεϊνών Hu, ο λειτουργικός ρόλος τους in vivo δεν είναι γνωστός. Ιδιαίτερα για την πρωτεΐνη HuR το γεγονός αυτό οφείλεται πρωτίστως στην συμμετοχή της σε θεμελιώδεις αναπτυξιακές διαδικασίες και την εμβρυική ανά- πτυξη όπως προκύπτει από συστήματα καθολικής της απαλοιφής στον ποντικό. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήσαμε διαγονιδιακές μεθοδολογίες επιλεκτικής γονιδιακής απενεργοποίησης για να ξεπεράσουμε τις εμβρυϊκές διεργασίες και να α- ποσαφηνίσουμε τον αποκλειστικό ρόλο της HuR σε κύτταρα που εκφράζουν μόνον αυτήν (σε κύτταρα της επίκτητης ανοσιακής απόκρισης και σε κύτταρα της γλοίας) έναντι κυττάρων που εκφράζουν όλες της Ηu (νευρικά κύτταρα). Ειδικότερα, και σε αυτό το πλαίσιο προσπαθήσαμε να αποσαφηνίσουμε τον λειτουργικό ρόλο της HuR: Στην ωρίμανση και στις φυσιολογικές/αυτοάνοσες αντιδράσεις των Τ- λεμφοκυττάρων Στην εκφυλιστική αντίδραση νευρώνων του Κεντρικού Νευρικού Συστή- ματος Στην εκφυλιστική αντίδραση των κυττάρων της ολιγοδενδρογλοίας του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος .........................................................................................................................................................