Διερεύνηση της ερυθροποιητικής απάντησης στην υποξαιμία ατόμων με χρόνιες πνευμονοπάθειες

Abstract

The aim of this study is to investigate the erythropoietic response to hypoxemia in chronic pulmonary disease. The study includes three parts: 1. Macrocytosis is a common finding in patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). The cause for the elevation of MCV in these patients remains elusive. In an attempt to determine the extent of macrocytosis in COPD patients and search for possible causative factors, we evaluated the hematologic parameters, F cell percentage, blood gases and serum Epo levels in 32 COPD clinically stable patients and 34 sex- and age-matched non-smoker healthy volunteers. An increased MCV was observed in almost half of the hypoxemic COPD cases (14/32 or 43.75%), while erythrocytosis developed to a lesser degree (37.5%). The erythropoietic response did not correlate with the severity of hypoxia. Moreover, no significant correlation was found between macrocytosis and hypoxemia or erythrocytosis and red cell size. In some cases the two phenomena occurred independently. The F cell percentage was significantly elevated in the COPD group (p<0.01) and was associated with MCV values (n=32, r=0.41, p<0.05). This finding supports the hypothesis we put forward to explain the macrocytosis often observed in COPD, i.e., that the acute erythropoietic stress occurring repeatedly in these patients as a result of the frequent exacerbations may lead to waves of release of relatively immature red cells from the marrow, including an increased number of F-cells, reflecting the recruitment of normally dormant BFU- E, which maintain the program for γ-chain synthesis. The fact that erythrocytosis and macrocytosis, both being triggered by hypoxemia, do not occur consistently in all COPD patients indicates that many other factors may also intervene. 2. Long treatment with theophylline is often followed by a reduction of Hb levels, which is usually ascribed to the antagonistic activity between theophylline and adenosine (ADO) which leads to decreased Epo synthesis. This view is not unanimously accepted and several alternative explanations have been proposed. To evaluate the influence of theophylline on erythropoiesis in COPD we evaluated the hematologic parameters and Epo values in 32 patients with this condition. Twelve of them had been treated with theophylline (8mg/kg, daily) for at least 1 year; the other 20 patients had never received this drug. The severity of respiratory insufficiency was almost comparable in the 2 groups. A group of 34 sex- and age-matched healthy volunteers served as controls. Our findings failed to show any significant difference of the Hb and serum Epo values between the 2 COPD groups (treated and untreated). To further explore the underlying mechanisms, we studied the development of BFU-E-derived colonies in semisolid methylcellulose cultures in blood samples from 7 patients randomly selected from the above two groups. In addition, we studied the effects of theophylline on the erythroid cell development by adding this agent in erythroid cell cultures from 6 healthy volunteers at concentrations varying from 10-8 to 10-3 M. Our observations are summarized in that the serum of the theophylline- treated patients produced a significant inhibition of the growth of erythroid bursts in contrast to that of untreated patients and controls; this inhibition was concentration dependent. The fact that the Epo amount was consistently more than adequate for maximal erythropoietic development in all culture dishes, supports the hypothesis of a direct inhibitory action of theophylline on erythropoiesis, possibly through the enhanced apoptosis induced by this drug in several other types of cells. In spite of the clarity of these experiments, the influence of theophylline on the erythropoietic response of the COPD patients could not be proven, since the Hb levels did not show any significant differences. This controversy probably results from the intervention of other factors both on the serum levels of the drug and on the erythropoietic response of each individual marrow. 3. Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a chronic inflammatory process characterized by severe derangement of ventilation in the advanced stages of disease. However, erythrocytosis is considered infrequent in IPF. In an attempt to determine the potential relation between the blunted erythropoietic response and the chronic inflammation, we studied 9 patients (6 males and 3 females) suffering from IPF with severely affected respiratory function (PO₂ < 70mmHg) and 34 sex- and age-matched healthy volunteers. We evaluated the hematologic parameters, serum EPO, TNF-a, IL-6 and IL-8 levels. We further studied the development of BFU-E-derived colonies in semisolid methylcellulose cultures in blood samples from all patients. Hb and serum Epo levels were almost comparable between the 2 studied groups. On the contrary, serum TNF-a, IL-6, IL-8 values were significantly higher in patients with IPF (p<0.05, p<0.01, p<0.001 respectively). Serum of the patients induced a significant growth inhibition of erythroid bursts compared with that of controls (p<0.05, p<0.01). Moreover, there was an apparent increment in the number of BFU-e colonies when patients’ mononuclear cells were cultured in comparison with those of healthy subjects (p<0.05). Our findings suggest that in IPF there is an increased number of primitive erythroid progenitors, which fail to complete their proliferation and maturation in vivo. Cytokines released from alveolar macrophages seem to have not only local but also systemic effects, since the serum of these patients directly suppressed erythropoiesis. However, the in vivo decreased red blood cell production can not be entirely attributed to this suppression. Thus, we believe that there are many other factors in vivo acting either synergistically or additively, with final result the suboptimal erythropoietic response to hypoxia.

Σκοπός της μελέτης αυτής αποτέλεσε η διερεύνηση της ερυθροποιητικής απάντησης στην υποξαιμία της χρόνιας πνευμονοπάθειας. Η παρούσα εργασία περιλαμβάνει τρία σκέλη: I. Εξετάστηκαν 40 ασθενείς με ΧΑΠ στο στάδιο της αναπνευστικής ανεπάρκειας και 38 φυσιολογικοί μάρτυρες, μη καπνιστές, ανάλογης ηλικίας και φύλου, με σκοπό να καθορισθεί η συχνότητα εμφάνισης ερυθροκυττάρωσης και μακροκυττάρωσης στα άτομα αυτά και να αναζητηθούν οι υπεύθυνοι μηχανισμοί. Προσδιορίσθηκαν οι αιματολογικές παράμετροι, το ποσοστό των F-κυττάρων, τα αέρια αίματος και τα επίπεδα ερυθροποιητίνης. Αυξημένος ερυθροκυτταρικός όγκος (MCV>95fl) σημειώθηκε στους μισούς σχεδόν ασθενείς (43.75%), ενώ ερυθροκυττάρωση βρέθηκε σε μικρότερο ποσοστό (37.5%). Το μέγεθος της ερυθροποιητικής απάντησης δε σχετίζονταν με τη βαρύτητα της υποξαιμίας. Επιπλέον δεν διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ μακροκυττάρωσης και υποξαιμίας, ή μακροκυττάρωσης και ερυθροκυττάρωσης, μάλιστα σε μερικές περιπτώσεις οι δύο εκδηλώσεις εμφανίζονταν ανεξάρτητα. Εξίσου αξιόλογο εύρημα αποτελεί η παρουσία αυξημένου αριθμού F-κυττάρων στους υποξαιμικούς ασθενείς (p<0.01) και η ισχυρή στατιστική συσχέτιση του ποσοστού των F- κυττάρων με το βαθμό της μακροκυττάρωσης (n=32, r=0.41,p<0.05), γεγονός που επιτρέπει την αιτιολογική συσχέτιση των δύο παραμέτρων. II. Ελαττωμένη παραγωγή ερυθροποιητίνης κατά τη λήψη θεοφυλλίνης, με συνέπεια την μείωση των επιπέδων της αιμοσφαιρίνης έχει αναφερθεί από πολλούς ερευνητές. Προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της θεοφυλλίνης στην ερυθροποιητική απάντηση της χρόνιας υποξαιμίας, μελετήθηκαν 32 ασθενείς με ΧΑΠ, από τους οποίους οι 12 (ομάδα Α, 8 άντρες και 4 γυναίκες) έκαναν χρήση του φαρμάκου και οι 20 (ομάδα Β, 14 άντρες και 6 γυναίκες) όχι. Υπεβλήθησαν σε βασικό αιματολογικό έλεγχο και προσδιορίστηκαν τα επίπεδα ερυθροποιητίνης στον ορό. Παράλληλα μελετήθηκαν 32 φυσιολογικοί μάρτυρες (20 άντρες και 12 γυναίκες). Και οι 3 ομάδες ήταν ανάλογης ηλικίας και φύλου, ενώ η βαρύτητα της αναπνευστικής ανεπάρκειας, εκφραζόμενη με το βαθμό της υποξαιμίας (ΡΟ2), ήταν σχεδόν παρόμοια στις δύο ομάδες των πνευμονοπαθών. Εν συνεχεία πραγματοποιήθηκαν ημιστερεές καλλιέργειες σε μεθυλοκυτταρίνη κυττάρων περιφερικού φλεβικού αίματος, παρουσία Epo (2U/ml), 7 ασθενών με ΧΑΠ που βρίσκονταν υπό μακροχρόνια αγωγή με θεοφυλλίνη και 7 ασθενών με ΧΑΠ που δε λάμβαναν θεοφυλλίνη. Επίσης, έγιναν 6 ημιστερεές κυτταρικές καλλιέργειες σε μεθυλοκυτταρίνη με Εpο χρησιμοποιώντας περιφερικό φλεβικό αίμα υγιών ατόμων και προσθέτοντας στο θρεπτικό υλικό θεοφυλλίνη σε διάφορες συγκεντρώσεις (10-8 έως 10-3Μ). Τα ευρήματα μας έδειξαν την απουσία στατιστικά σημαντικής διαφοράς για τις τιμές Hb και Εpο μεταξύ των ασθενών που έκαναν χρήση ή όχι του φαρμάκου, ενώ οι τιμές Hb των πνευμονοπαθών διέφεραν σημαντικά από εκείνες των υγιών μαρτύρων (p<0.001και p<0.02, για την ομάδα A και Β αντίστοιχα). Σαφής ήταν η μείωση του αριθμού των παραγόμενων αποικιών από τα BFUe’s μετά την προσθήκη ορού ασθενούς που λάμβανε θεοφυλλίνη σε σχέση με την επίδραση ορού ασθενούς που δεν χρησιμοποιούσε το φάρμακο ή φυσιολογικού ορού στο ίδιο κυτταρικό δυναμικό (p<0.01 και p<0.05, όταν χρησιμοποιήθηκε κυτταρικό δυναμικό ασθενών και μαρτύρων αντίστοιχα). Επίσης καταγράφηκε σημαντική αναστολή της ερυθροποίησης (p<0.05), όταν στο ίδιο κυτταρικό δυναμικό προσθέσαμε in vitro θεοφυλλίνη σε συγκεντρώσεις 10-3 και 10-4Μ. Το φαινόμενο δεν εμφανίζονταν με μικρότερες συγκεντρώσεις της ουσίας. ΙΙΙ. Προκειμένου να ελεγχθεί η ύπαρξη πιθανής συσχέτισης μεταξύ της μειωμένης ερυθροκυτταρικής απάντησης στο υποξαιμικό ερέθισμα και της χρόνιας φλεγμονώδους εξεργασίας στην ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση μελετήθηκαν σε 9 ασθενείς με ΙΠΙ, των οποίων η πνευμονική λειτουργία είχε σοβαρά επηρεασθεί από τη νόσο (PO₂<70mmHg) και σε 32 φυσιολογικούς μάρτυρες, μη καπνιστές, ανάλογης ηλικίας και φύλου οι κάτωθι παράμετροι: επίπεδα Hb, Εpο, TNF-α, IL-6 και IL-8. Παράλληλα πραγματοποιήθηκαν ημιστερεές καλλιέργειες σε μεθυλοκυτταρίνη κυττάρων περιφερικού φλεβικού αίματος ασθενών με ΙΠΙ και μαρτύρων, παρουσία Εpο και ορού των 2 ομάδων, με σκοπό την καταγραφή της ανάπτυξης των αποικιών της ερυθράς σειράς. Παρά το έντονο υποξαιμικό ερέθισμα, δεν καταγράφηκε στατιστικά σημαντική αύξηση στα επίπεδα Hb και Εpο των ασθενών, συγκριτικά με τους υγιείς μάρτυρες. Αντιθέτως, οι τιμές τόσο του TNF-a (p<0.05), όσο και της IL-6 (p<0.05) και IL-8 (p<0.01) στον ορό των ασθενών παρουσίασαν σημαντική αύξηση σε σχέση με τους μάρτυρες. Εμφανής ήταν η μείωση του αριθμού των παραγόμενων αποικιών από τα προγονικά κύτταρα της ερυθράς BFUe’s, μετά την προσθήκη ορού ασθενών σε σχέση με την επίδραση φυσιολογικού ορού στο ίδιο κυτταρικό δυναμικό (p<0.05 και p<0.01 όταν χρησιμοποιήθηκε κυτταρικό δυναμικό ασθενών και μαρτύρων αντίστοιχα). Αξιοσημείωτη ήταν και η ανάπτυξη πολύ μεγαλύτερου αριθμού ερυθροειδών αποικιών BFU-E, όταν χρησιμοποιήθηκε κυτταρικό δυναμικό ασθενών, σε σχέση με εκείνο υγιών μαρτύρων στις ίδιες καλλιεργητικές συνθήκες (p<0.05). Στηριζόμενοι στα παραπάνω ευρήματα συμπεραίνουμε τα κάτωθι: οι μισοί περίπου ασθενείς με Χ.Α.Π. αναπτύσσουν μακροκυττάρωση, η οποία τουλάχιστον σε κάποιο βαθμό συνοδεύεται από αυξημένη παραγωγή F-κυττάρων. Θεωρούμε ότι κοινός παράγοντας αυτών των μεταβολών αποτελεί η αυξημένη κινητοποίηση άωρων προγονικών της ερυθράς εξαιτίας του ερυθροποιητικού stress, λόγω των συχνών υποξαιμικών επεισοδίων. Όμως αν και η υποξαιμία της ΧΑΠ φαίνεται να αποτελεί τον εκλυτικό παράγοντα τόσο για την ερυθροκυττάρωση, όσο και την άνοδο του MCV, πολλοί άλλοι παράγοντες επιδρούν και επηρεάζουν τις δύο παραμέτρους κατά τρόπο διαφορετικό. Σχετικά με την επίδραση της θεοφυλλίνης, το γεγονός ότι σε όλα τα τρυβλία το καλλιεργητικό μέσο περιείχε ικανή ποσότητα Εpο για να εξασφαλίσει την ερυθροποιητική εξέλιξη, συνηγορεί υπέρ της άμεσης δράσης της θεοφυλλίνης στο ρυθμό της ερυθροποίησης, η οποία πιθανόν συσχετίζεται με την αποδιδόμενη στην ουσία αυτή επιτάχυνση της απόπτωσης σε άλλους κυτταρικούς πληθυσμούς. Η δοσοεξαρτώμενη δράση του φαρμάκου, αλλά και η παρουσία άλλων παραγόντων, λιγότερο γνωστών και δύσκολο να ελεγχθούν, που διαμορφώνουν την τελική ερυθροποιητική απάντηση ερμηνεύουν την αντιφατικότητα των κλινικών βιβλιογραφικών πληροφοριών. Τέλος, για τη μειωμένη ερυθροποιητική απάντηση στην ΙΠΙ συμπεραίνουμε τα εξής: η παραγωγή κυτοκινών από τα κυψελιδικά μακροφάγα έχει όχι μόνο τοπική αλλά και συστηματική δράση. Ο ορός των ασθενών αυτών προκαλεί άμεση αναστολή της ερυθροποίησης, αλλά όχι σε βαθμό ικανό να ερμηνεύσει πλήρως το φαινόμενο. Στους ασθενείς με ΙΠΙ, υπάρχουν περισσότερα άωρα προγονικά κύτταρα της ερυθράς σειράς, των οποίων όμως η ωρίμανση και ο πολλαπλασιασμός in vivo προφανώς δεν ολοκληρώνεται. Τούτο είναι ενδεικτικό της παρουσίας in vivo κατασταλτικών παραγόντων της ερυθροποίησης, οι οποίοι απουσιάζουν από τις in vitro συνθήκες των κυτταρικών καλλιεργειών.